Purification des canaux potentiels des récepteurs transitoires endogènes de la drosophile
Summary
Sur la base du mécanisme d’assemblage du complexe protéique INAD, dans ce protocole, une stratégie modifiée de purification d’affinité et de compétition a été développée pour purifier le canal endogène TRP de la drosophile .
Abstract
La phototransduction de la drosophile est l’une des voies de signalisation couplées à la protéine G les plus rapides connues. Pour assurer la spécificité et l’efficacité de cette cascade, le canal cationique perméable au calcium (Ca2+), le potentiel récepteur transitoire (TRP), se lie étroitement à la protéine de l’échafaudage, l’inactivation sans potentiel Après potentiel D (INAD), et forme un grand complexe protéique de signalisation avec la protéine kinase C (ePKC) spécifique à l’œil et le potentiel de récepteur Cβ/No de la phospholipase A (PLCβ/NORPA). Cependant, les propriétés biochimiques du canal TRP de la drosophile restent floues. Sur la base du mécanisme d’assemblage du complexe protéique INAD, une purification d’affinité modifiée et une stratégie de compétition ont été développées pour purifier le canal endogène TRP. Tout d’abord, le fragment NORPA 863-1095 purifié marqué à l’histidine (His) a été lié à des perles de Ni et utilisé comme appât pour extraire le complexe protéique endogène de l’INAD des homogénats de tête de drosophile. Ensuite, un fragment TRP 1261-1275 purifié excessif marqué par la glutathion S-transférase (GST) a été ajouté aux perles de Ni pour concurrencer le canal TRP. Enfin, le canal TRP dans le surnageant a été séparé du peptide TRP 1261-1275 excessif par chromatographie d’exclusion de taille. Cette méthode permet d’étudier le mécanisme de contrôle du canal TRP de la drosophile sous des angles biochimiques et structurels. Les propriétés électrophysiologiques des canaux TRP purifiés de la drosophile peuvent également être mesurées à l’avenir.
Introduction
La phototransduction est un processus où les photons absorbés sont convertis en codes électriques des neurones. Il relaie exclusivement les opsines et la cascade de signalisation couplée à la protéine G suivante chez les vertébrés et les invertébrés. Chez la drosophile, en utilisant ses cinq domaines PDZ, l’inactivation de la protéine d’échafaudage sans potentiel postérieur D (INAD) organise un complexe de signalisation supramoléculaire, qui se compose d’un canal de potentiel de récepteur transitoire (TRP), de potentiel de récepteur Cβ/No de la phospholipase A (PLCβ/NORPA) et d’une protéine kinase C (ePKC)1 spécifique à l’œil. La formation de ce complexe de signalisation supramoléculaire garantit la localisation subcellulaire correcte, une efficacité élevée et la spécificité de la machinerie de phototransduction de la drosophile. Dans ce complexe, les canaux TRP sensibles à la lumière agissent comme des effecteurs en aval de NORPA et médient l’afflux de calcium et la dépolarisation des photorécepteurs. Des études antérieures ont montré que l’ouverture du canal TRP de la drosophile est médiée par les protons, la perturbation de l’environnement lipidique local ou la force mécanique 2,3,4. Le canal TRP de la drosophile interagit également avec la calmoduline5 et est modulé par le calcium par rétroaction positive et négative 6,7,8.
Jusqu’à présent, les études d’électrophysiologie sur le mécanisme de contrôle des canaux TRP et TRP-like (TRPL) de la drosophile étaient basées sur des patchs membranaires excisés, des enregistrements de cellules entières de photorécepteurs dissociés de type sauvage de la drosophile et des canaux hétéro-exprimés dans les cellulesS2, SF9 ou HEK 2,9,10,11,12,13, mais pas sur les canaux purifiés. Les informations structurelles du canal TRP complet de la drosophile restent également floues. Afin d’étudier les propriétés électrophysiologiques des protéines purifiées dans un environnement membranaire reconstitué et d’obtenir des informations structurelles sur le canal TRP de drosophile sur toute la longueur, l’obtention de canaux TRP purifiés sur toute la longueur est la première étape nécessaire, similaire aux méthodologies utilisées dans les études des canaux TRP des mammifères 14,15,16,17.
Récemment, sur la base du mécanisme d’assemblage du complexe protéique INAD 18,19,20, une stratégie de purification d’affinité et de compétition a d’abord été développée pour purifier le canal TRP des homogénats de tête de drosophile par des billes de streptavidine 5. Compte tenu de la faible capacité et du coût élevé des perles de streptavidine, un protocole de purification amélioré est introduit ici qui utilise la protéine d’appât marquée His et les perles Ni correspondantes à faible coût avec une capacité beaucoup plus élevée. La méthode proposée aidera à étudier le mécanisme de contrôle du canal TRP sous des angles structurels et à mesurer les propriétés électrophysiologiques du canal TRP avec des protéines purifiées.
Protocol
Representative Results
Discussion
INAD, qui contient cinq domaines PDZ, est le principal organisateur des machines de phototransduction de la drosophile. Des études antérieures ont montré que INAD PDZ3 se lie à la queue C-terminale du canal TRP avec une spécificité exquise (KD = 0,3 μM)18. Le tandem INAD PDZ45 interagit avec le fragment NORPA 863-1095 avec une affinité de liaison extrêmement élevée (KD = 30 nM). Ces résultats fournissent une base biochimique solide pour concevoir la strat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (n° 31870746), shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) et natural Science Foundation of Guangdong Province, China (No. 2021A1515010796) à W. L. Nous remercions LetPub (www.letpub.com) pour son assistance linguistique lors de la préparation de ce manuscrit.
Materials
| Bacterial strains | |||
| BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | Protein overexpression |
| Experiment models | |||
| D.melanogaster: W1118 strain | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:3605 | Drosophila head preparation |
| Material | |||
| 20/30/40 mesh stainless steel sieves | Jiufeng metal mesh company | GB/T6003.1 | Drosophila head preparation |
| 30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) | Lablead | A3291 | SDS-PAGE gel preparation |
| Ammonium Persulfate | Invitrogen | HC2005 | SDS-PAGE gel preparation |
| Cocktail protease inhibitor | Roche | 05892953001 | Protease inhibitor |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech | A100472-0025 | SDS-PAGE gel staining |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sangon Biotech | A620058-0100 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) | Sangon Biotech | A500838-0500 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Glycine | Sangon Biotech | A610235-0005 | SDS-PAGE buffer preparation |
| Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads | Cytiva | 17513202 | Affinity chromatography |
| Imidazole | Sangon Biotech | A500529-0001 | Elution buffer preparation for Ni-column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sangon Biotech | A600168-0025 | Induction of protein overexpression |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002-0250 | E.coli. cell culture |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma-aldrich | G4251-100G | Elution buffer preparation for Glutathione beads |
| Ni-Sepharose excel beads | Cytiva | 17371202 | Affinity chromatography |
| N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) | Sangon Biotech | A610424-001 | Detergent for protein purification |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-aldrich | T9281-100ML | SDS-PAGE gel preparation |
| PBS | Sangon Biotech | E607008-0500 | Homogenization buffer for E.coli. cell |
| PMSF | Lablead | P0754-25G | Protease inhibitor |
| Prestained protein marker | Thermo Scientific | 26619/26616 | Prestained protein ladder |
| Size exclusion column (preparation grade) | Cytiva | 28989336 | HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column |
| Size exclusion column (analytical grade) | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL column |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218-0001 | Protein purification buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sangon Biotech | A500228-0001 | SDS-PAGE gel/buffer preparation |
| Tris base | Sigma-aldrich | T1503-10KG | Protein purification buffer preparation |
| Ultrafiltration spin column | Millipore | UFC901096/801096 | Protein concentration |
| Equipment | |||
| Analytical Balance | DENVER | APX-60 | Metage of Drosophila head |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes | Eppendorf | 5810R | Protein concentration |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes | Eppendorf | 5417R | Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) | Bio-Rad | 738-0015 | TRP protein purification |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) | Bio-Rad | 738-0017 | Bait and competitor protein purification from E.coli. |
| Gel Documentation System | Bio-Rad | Universal Hood II Gel Doc XR System | SDS-PAGE imaging |
| High-speed refrigerated centrifuge | Beckman coulter | Avanti J-26 XP | Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate |
| High pressure homogenizer | UNION-BIOTECH | UH-05 | Homogenization of E.coli. cells |
| Liquid nitrogen tank | Taylor-Wharton | CX-100 | Drosophila head preparation |
| Protein purification system | Cytiva | AKTA purifier | Protein purification |
| Refrigerator (-80°C) | Thermo | 900GP | Drosophila head preparation |
| Spectrophotometer | MAPADA | UV-1200 | OD600 measurement of E.coli. cells |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | Determination of protein concentration |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Ultracentrifugation |
References
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