Génération de mutants nuls pour élucider le rôle des glycosyltransférases bactériennes dans la motilité bactérienne

La glycosylation des protéines a été décrite chez les bactéries Gram positif et Gram négatif et consiste en la fixation covalente d’un glycane à une chaîne latérale d’acide aminé ^1,2. Chez les procaryotes, ce processus se produit généralement via deux mécanismes enzymatiques majeurs: O- et N-glycosylation ³. Dans l’O-glycosylation, le glycane est attaché au groupe hydroxyle d’un résidu de sérine (Ser) ou de thréonine (Thr). Dans la N-glycosylation, le glycane est attaché à l’azote amide de la chaîne latérale d’un résidu d’asparagine (Asn) dans les séquences tripeptides Asn-X-Ser/Thr, où X pourrait être n’importe quel acide aminé à l’exception de la proline.

Les glycanes peuvent adopter des structures linéaires ou ramifiées et sont composés de monosaccharides ou de polysaccharides liés de manière covalente par des liaisons glycosidiques. Chez les procaryotes, les glycanes présentent généralement une diversité dans la composition et la structure du sucre par rapport aux glycanes eucaryotes⁴. En outre, deux voies de glycosylation bactériennes différentes qui diffèrent dans la façon dont le glycane est assemblé et transféré à la protéine acceptrice ont été décrites: glycosylation séquentielle et en bloc ^5,6. Pour la glycosylation séquentielle, le glycane complexe est construit directement sur la protéine par addition successive de monosaccharides. Dans la glycosylation en bloc, un glycane pré-assemblé est transféré à la protéine à partir d’un oligosaccharide lié aux lipides par une oligosaccharyltransférase spécialisée (OTase). Il a été démontré que les deux voies sont impliquées dans les processus de glycosylation N et O ⁷.

La glycosylation des protéines joue un rôle dans la modulation des propriétés physico-chimiques et biologiques des protéines. La présence d’un glycane peut influencer la façon dont la protéine interagit avec son ligand, ce qui affecte l’activité biologique de la protéine, mais peut également affecter la stabilité des protéines, la solubilité, la susceptibilité à la protéolyse, l’immunogénicité et les interactions microbe-hôte ^8,9. Cependant, plusieurs paramètres de glycosylation, tels que le nombre de glycanes, la composition du glycane, la position et le mécanisme d’attachement, pourraient également affecter la fonction et la structure des protéines.

Les glycosyltransférases (GT) sont les enzymes clés dans la biosynthèse des glycanes complexes et des glycoconjugués. Ces enzymes catalysent la formation de liaison glycosidique entre une fraction de sucre d’une molécule donneuse activée et un accepteur de substrat spécifique. Les GT peuvent utiliser à la fois des nucléotides et des non-nucléotides comme molécules donneuses et cibler différents accepteurs de substrat, tels que des protéines, des saccharides, des acides nucléiques et des lipides¹⁰. Par conséquent, la compréhension des GT au niveau moléculaire est importante pour identifier leurs mécanismes d’action et leur spécificité, et permet également de comprendre comment la composition en sucre des glycanes qui modifient les molécules pertinentes est liée à la pathogénicité. La base de données sur les enzymes glucidiques actives (CAZy)¹¹ classe les GT en fonction de leur homologie de séquence, ce qui fournit un outil prédictif puisque, dans la plupart des familles GT, le pli structurel et les mécanismes d’action sont invariants. Cependant, quatre raisons rendent difficile la prédiction de la spécificité du substrat de nombreux GT : 1) aucun motif de séquence clair déterminant la spécificité du substrat n’a été déterminé chez les procaryotes¹², 2) de nombreux GT et OTases montrent la promiscuité du substrat^13,14, 3) les GT fonctionnels sont difficiles à produire à haut rendement sous forme recombinante et 4) l’identification des substrats donneurs et accepteurs est complexe. Malgré cela, des études récentes sur la mutagénèse ont permis d’obtenir des avancées significatives dans la compréhension des mécanismes catalytiques et de soustraire la liaison des GT.

Chez les bactéries, l’O-glycosylation semble être plus répandue que la N-glycosylation. Les sites d’O-glycosylation ne montrent pas de séquence consensuelle, et de nombreuses protéines O-glycosylées sont sécrétées ou des protéines de surface cellulaire, telles que les flagellines, les pili ou les autotransporteurs¹. La glycosylation de la flagelle montre une variabilité dans le nombre de sites accepteurs, la composition du glycane et la structure. Par exemple, les flagellines de Burkholderia spp n’ont qu’un seul site d’acceptation, tandis que chez Campylobacter jejuni, les flagellènes ont jusqu’à 19 sites d’acceptation^15,16. De plus, pour certaines bactéries, le glycane est un monosaccharide unique, tandis que d’autres bactéries possèdent des glycanes hétérogènes compromis de différents monosaccharides pour former des oligosaccharides. Cette hétérogénicité se produit même parmi les souches de la même espèce. Les flagellines Helicobacter ne sont modifiées que par l’acide pseudaminique (PseAc)¹⁷, et les flagellines campylobacter peuvent être modifiées par PseAc, la forme acétamidino de l’acide pseudaminique (PseAm) ou de l’acide légionaminique (LegAm), et les glycanes dérivés de ces sucres avec de l’acétyle, de la N-acétylglucosamine ou des substitutions propioniques ^18,19. Chez Aeromonas, les flagellènes sont modifiées par des glycanes dont la composition va d’un seul dérivé de l’acide PseAc à un hétéropolysaccharide²⁰, et la fixation des glycanes aux monomères de flagelline se fait toujours via un dérivé PseAc.

En général, la glycosylation des flagellènes est essentielle pour l’assemblage du filament flagellaire, la motilité, la virulence et la spécificité de l’hôte. Cependant, alors que les flagellènes de C. jejuni¹⁶, H. pylori^{17 et} Aeromonas sp. ²¹ ne peut s’assembler en filament que si les monomères de protéines sont glycosylés, Pseudomonas spp. et Burkholderia spp. ¹⁵ ne nécessitent pas de glycosylation pour l’assemblage des flagelles. De plus, chez certaines souches de C. jejuni, les changements dans la composition en sucre du flagelle glycane affectent l’interaction bactérie-hôte et peuvent jouer un rôle dans l’évasion de certaines réponses immunitaires¹⁶. L’autoagglutination est une autre caractéristique phénotypique affectée par les modifications de la composition des glycanes associées aux flagellines. Une autoagglutination plus faible entraîne une réduction de la capacité à former des microcolonies et du biofilm²². Chez certaines bactéries, la capacité des flagelles à déclencher une réponse pro-inflammatoire était liée à la glycosylation de la flagelline. Ainsi, chez P. aeruginosa, la flagelline glycosylée induit une réponse pro-inflammatoire plus élevée que le²³ non glycolycosylé.

Les Aeromonas sont des bactéries à Gram négatif omniprésentes dans l’environnement, ce qui leur permet d’être à l’interface de tous les composants one health ²⁴. Les Aeromonas mésophiles ont un seul flagelle polaire, qui est produit de manière constitutive. Plus de la moitié des isolats cliniques expriment également la flagelline latérale, inductible dans des milieux ou des plaques à haute viscosité. Différentes études ont lié les deux types de flagelles aux premiers stades de la pathogenèse bactérienne²⁵. Alors que les flagellules polaires rapportées à ce jour sont O-glycosylées à 5-8 résidus Ser ou Thr de ses domaines immunogènes centraux, les flagellines latérales ne sont pas O-glycosylées dans toutes les souches. Bien que les glycanes flagelles polaires de différentes souches présentent une diversité dans leur composition glucidique et leur longueur de chaîne²⁰, il a été démontré que le sucre de liaison est un dérivé de l’acide pseudaminique.

Le but de ce manuscrit est de décrire une méthode permettant d’obtenir des mutants nuls dans des GT spécifiques ou des régions chromosomiques contenant des GT afin d’analyser leur implication dans la biosynthèse des polysaccharides pertinents et dans la pathogénicité bactérienne, ainsi que le rôle du glycane lui-même. À titre d’exemple, nous identifions et supprimons une région chromosomique contenant des GT d’Aeromonas pour établir son implication dans la glycosylation de la flagelline polaire et analyser le rôle du glycane de flagelline. Nous montrons comment supprimer un GT spécifique pour établir sa fonction dans la biosynthèse de ce glycane et le rôle du glycane modifié. Bien qu’en utilisant Aeromonas comme exemple, le principe peut être utilisé pour identifier et étudier les îlots de glycosylation flagelle d’autres bactéries à Gram négatif et analyser la fonction des GT impliqués dans la biosynthèse d’autres glycanes tels que le lipopolysaccharide O-antigène.