יצירת מוטציות ריקות כדי להבהיר את תפקידם של גליקוזילטרנספראזות חיידקיות בתנועתיות חיידקית

גליקוזילציה של חלבונים תוארה הן בחיידקים גראם-חיוביים והן בחיידקים גראם-שליליים והיא מורכבת מהצמדה קוולנטית של גליקאן לשרשרת צד של חומצת אמינו ^1,2. אצל פרוקריוטים, תהליך זה מתרחש בדרך כלל באמצעות שני מנגנונים אנזימטיים עיקריים: O- ו– N-glycosylation ³. ב-O-glycosylation, הגליקן מחובר לקבוצת ההידרוקסיל של שאריות סרין (Ser) או תראונין (Thr). ב-N-גליקוזילציה, הגליקן מחובר לשרשרת הצדדית של חנקן אמיד של שאריות אספרגין (Asn) בתוך רצפי הטריפפטידים Asn-X-Ser/Thr, כאשר X יכול להיות כל חומצת אמינו למעט פרולין.

גליקנים יכולים לאמץ מבנים ליניאריים או מסועפים והם מורכבים מחד-סוכרים או מפוליסכרידים המקושרים באופן קוולנטי על ידי קשרים גליקוזידיים. אצל פרוקריוטים, גליקנים בדרך כלל מראים גיוון בהרכב הסוכר ובמבנהו בהשוואה לגליקנים אאוקריוטים⁴. יתר על כן, תוארו שני מסלולי גליקוזילציה חיידקיים שונים הנבדלים זה מזה באופן שבו הגליקן מורכב ומועבר לחלבון המקבל: גליקוזילציה רציפה ו-en bloc ^5,6. עבור גליקוזילציה רציפה, הגליקן המורכב בנוי ישירות על החלבון על ידי תוספת רצופה של חד-סוכרים. ב-en bloc glycosylation, גליקאן שהורכב מראש מועבר לחלבון מאוליגוזכריד המקושר בשומנים על ידי אוליגוסכריל-טרנספראז (OTase) מיוחד. שני המסלולים הוכחו כמעורבים בתהליכי N ו-O-glycosylation ⁷.

לגליקוזילציה של חלבונים יש תפקיד בוויסות התכונות הפיזיקוכימיות והביולוגיות של חלבונים. נוכחותו של גליקאן יכולה להשפיע על האופן שבו החלבון מתקשר עם הליגנד שלו, מה שמשפיע על הפעילות הביולוגית של החלבון, אך יכול גם להשפיע על יציבות החלבון, המסיסות, הרגישות לפרוטאוליזה, אימונוגניות ואינטראקציות בין חיידקים לפונדקאים ^8,9. עם זאת, מספר פרמטרים של גליקוזילציה, כגון מספר הגליקנים, הרכב הגליקן, המיקום ומנגנון ההתקשרות, עשויים גם הם להשפיע על תפקוד ומבנה החלבון.

גליקוסילטרנספראזות (GTs) הם האנזימים המרכזיים בביוסינתזה של גליקנים וגליקו-קונג’וגטים מורכבים. אנזימים אלה מזרזים את היווצרות הקשר הגליקוזידי בין מוטי סוכר ממולקולת תורם פעילה לבין מקבל מצע מסוים. GTs יכולים להשתמש הן בנוקלאוטידים והן בנון-נוקלאוטידים כמולקולות תורמות ולמקד מקבלי מצעים שונים, כגון חלבונים, סכרידים, חומצות גרעין וליפידים¹⁰. לכן, הבנת ה-GTs ברמה המולקולרית חשובה כדי לזהות את מנגנוני הפעולה והספציפיות שלהם, וגם מאפשרת להבין כיצד הרכב הסוכר של הגליקנים שמשנים מולקולות רלוונטיות קשור לפתוגניות. מסד הנתונים של האנזים הפעיל בפחמימות (CAZy)¹¹ מסווג GTs על פי הומולוגיה של הרצף שלהם, המספקת כלי חיזוי שכן, ברוב משפחות GT, הקפל המבני ומנגנוני הפעולה הם אינווריאנטים. עם זאת, ארבע סיבות מקשות על חיזוי ספציפיות המצע של GTs רבים: 1) לא נקבע מוטיב רצף ברור הקובע את ספציפיות המצע בפרוקריוטים¹², 2) GTs ו- OTases רבים מראים הפקרות מצע^13,14, 3) GTs פונקציונליים קשה לייצר בתפוקה גבוהה בצורה רקומביננטית ו -4) הזיהוי של מצעי התורם והמקבלים הוא מורכב. למרות זאת, מחקרי מוטגנזה שנערכו לאחרונה אפשרו להשיג התקדמות משמעותית בהבנת המנגנונים הקטליטיים ולחסר את הקשירה של GTs.

בחיידקים, נראה כי O-גליקוזילציה שכיחה יותר מאשר N-גליקוזילציה. אתרי ה-O-glycosylation אינם מראים רצף קונצנזוס, ורבים מחלבוני ה-O-glycosylated מופרשים או חלבונים על פני התא, כגון פלאגלינים, פילי או אוטו-טרנספורטרים¹. הגליקוזילציה של פלאגלין מראה שונות במספר האתרים המקבלים, בהרכב הגליקן ובמבנה. לדוגמה, ל-Burkholderia spp flagellins יש רק אתר מקבל אחד, בעוד שבקמפילובקטר ג’ג’וני, לפלגלנים יש לא פחות מ-19 אתרים מקבלים^15,16. יתר על כן, עבור חלק מהחיידקים, הגליקן הוא חד-סוכר יחיד, בעוד שחיידקים אחרים הם בעלי גליקנים הטרוגניים הטרוגניים שנפגעו מחד-סוכרים שונים ויוצרים אוליגוסכרידים. ההטרוגניות הזו מתרחשת אפילו בקרב זנים מאותו המין. הליקובקטר פלאגלינים משתנים רק על ידי חומצה פסאודאמינית (PseAc)¹⁷, וניתן לשנות את קמפילובקטר פלאגלינים על ידי PseAc, צורת האצטאמידינו של החומצה הפסאודמינית (PseAm) או חומצה לגיונאמינית (LegAm), וגליקנים המופקים מסוכרים אלה עם אצטיל, N-אצטילגלוקוסאמין, או תחליפים פרופיוניים ^18,19. ב-Aeromonas, פלאגלינים משתנים על ידי גליקנים שהרכבם נע בין נגזרת אחת של חומצת PseAc להטרופוליסכריד²⁰, והחיבור של גליקנים למונומרים של פלגלין הוא תמיד באמצעות נגזרת PseAc.

באופן כללי, גליקוזילציה של פלאגלינים חיונית להרכבת חוטים, תנועתיות, אלימות וספציפיות מארח. עם זאת, בעוד דגלונים של C. jejuni¹⁶, H. pylori^17, ו – Aeromonas sp. ²¹ לא יכול להרכיב לתוך נימה אלא אם כן מונומרים חלבון הם glycosylated, Pseudomonas spp. ו Burkholderia spp. ¹⁵ אינם דורשים גליקוסילציה להרכבת פלגלה. יתר על כן, בחלק מזני C. jejuni , שינויים בהרכב הסוכר של הגליקן פלאגלה משפיעים על האינטראקציה בין חיידק לפונדקאי ועשויים למלא תפקיד בהתחמקות מתגובות חיסוניות מסוימות¹⁶. Autoagglutination הוא מאפיין פנוטיפי נוסף המושפע משינויים בהרכב של גליקנים הקשורים flagellins. אוטו-אגלוטינציה נמוכה יותר מובילה להפחתה ביכולת ליצור מיקרוקולוניות וביופילם²². בחיידקים מסוימים, היכולת של פלגלה לעורר תגובה פרו-דלקתית נקשרה לגליקוזילציה של פלגלין. לכן, ב P. aeruginosa, גליקוזילציה flagellin משרה תגובה פרו דלקתית גבוהה יותר מאשר unglycosylated²³.

אירומונס הם חיידקים גראם-שליליים הנמצאים בכל מקום בסביבה, מה שמאפשר להם להיות בממשק של כל רכיבי One Health ²⁴. לאירומונים מזופיליים יש פלאגלום קוטבי יחיד, המיוצר באופן מכונן. יותר ממחצית המבודדים הקליניים מבטאים גם פלאגלין לרוחב, בלתי ניתן להשראה במדיה או צלחות צמיגות גבוהה. מחקרים שונים קישרו בין שני סוגי הפלגלה לבין השלבים המוקדמים של פתוגנזה חיידקית²⁵. בעוד שפלגלינים קוטביים שדווחו עד כה הם O-גליקוזיליים ב-5-8 Ser או Thr שאריות של התחומים האימונוגניים המרכזיים שלו, פלאגלינים לרוחב אינם O-גליקוזיליים בכל הזנים. אף על פי שהגליקנים של פלגלה קוטבית מזנים שונים מראים גיוון בהרכב הפחמימות שלהם ובאורך השרשרת^{שלהם 20}, הסוכר המקשר הוכח כנגזרת של חומצה פסאודמינית.

מטרתו של כתב יד זה היא לתאר שיטה להשגת מוטציות ריקות ב-GTs או באזורים כרומוזומליים ספציפיים המכילים GTs כדי לנתח את מעורבותם בביוסינתזה של פוליסכרידים רלוונטיים ובפתוגניות חיידקית, כמו גם את תפקידו של הגליקן עצמו. כדוגמה, אנו מזהים ומוחקים אזור כרומוזומלי המכיל GTs של אירומונס כדי לבסס את מעורבותו בגליקוזילציה של פלאגלין קוטבי ולנתח את תפקידו של הגליקן פלאגלין. אנו מראים כיצד למחוק GT מסוים כדי לבסס את תפקודו בביוסינתזה של גליקאן זה ואת תפקידו של גליקאן שונה. למרות השימוש ב- Aeromonas כדוגמה, ניתן להשתמש בעיקרון כדי לזהות ולחקור איי גליקוזילציה של פלגלה של חיידקים גראם שליליים אחרים ולנתח את תפקודם של GTs המעורבים בביוסינתזה של גליקנים אחרים כגון O-אנטיגן ליפופוליסכריד.