Генерация нулевых мутантов для выяснения роли бактериальных гликозилтрансфераз в бактериальной подвижности

Гликозилирование белка было описано как у грамположительных, так и у грамотрицательных бактерий и состоит из ковалентного прикрепления гликана к аминокислотной боковой^{цепи 1,2}. У прокариот этот процесс обычно происходит через два основных ферментативных механизма: O- и N-гликозилирование ³. При О-гликозилировании гликан присоединяется к гидроксильной группе остатка серина (Ser) или треонина (Thr). При N-гликозилировании гликан присоединяется к боковой цепи амидного азота остатка аспарагина (Asn) в трипептидных последовательностях Asn-X-Ser/Thr, где X может быть любой аминокислотой, кроме пролина.

Гликаны могут принимать линейные или разветвленные структуры и состоят из моносахаридов или полисахаридов, ковалентно связанных гликозидными связями. У прокариот гликаны обычно демонстрируют разнообразие в составе и структуре сахара по сравнению с эукариотическими гликанами⁴. Кроме того, были описаны два различных пути бактериального гликозилирования, которые отличаются тем, как гликан собирается и переносится в акцепторный белок: последовательное и блоковое гликозилирование ^5,6. Для последовательного гликозилирования сложный гликан накапливается непосредственно на белке путем последовательного добавления моносахаридов. При гликозилировании в блоке предварительно собранный гликан переносится в белок из липидно-связанного олигосахарида специализированной олигосахарилтрансферазой (OTase). Было показано, что оба пути участвуют в процессах N- и O-гликозилирования ⁷.

Гликозилирование белка играет роль в модуляции физико-химических и биологических свойств белков. Присутствие гликана может влиять на то, как белок взаимодействует со своим лигандом, что влияет на биологическую активность белка, но также может влиять на стабильность белка, растворимость, восприимчивость к протеолизу, иммуногенность и взаимодействия микроб-хозяин ^8,9. Однако некоторые параметры гликозилирования, такие как количество гликанов, состав гликана, положение и механизм присоединения, также могут влиять на функцию и структуру белка.

Гликозилтрансферазы (ГТ) являются ключевыми ферментами в биосинтезе сложных гликанов и гликоконъюгатов. Эти ферменты катализируют образование гликозидной связи между фрагментом сахара из активированной донорской молекулы и специфическим акцептором субстрата. ГТ могут использовать как нуклеотиды, так и ненуклеотиды в качестве донорских молекул и нацеливаться на различные акцепторы субстрата, такие как белки, сахариды, нуклеиновые кислоты и липиды¹⁰. Поэтому понимание ГТ на молекулярном уровне важно для выявления их механизмов действия и специфичности, а также позволяет понять, как сахарный состав гликанов, которые модифицируют соответствующие молекулы, связаны с патогенностью. База данных активных ферментов углеводов (CAZy)¹¹ классифицирует GT в соответствии с их гомологией последовательностей, что обеспечивает прогностический инструмент, поскольку в большинстве семейств GT структурная складка и механизмы действия инвариантны. Однако четыре причины затрудняют прогнозирование субстратной специфичности многих ГТ: 1) у прокариот не определен четкий мотив последовательности, определяющий специфичность субстрата¹², 2) многие ГТ и ОТА показывают распущенность субстрата ^13,14, 3) функциональные ГТ трудно получить при высоком выходе в рекомбинантной форме и 4) идентификация как донорских, так и акцепторных субстратов сложна. Несмотря на это, недавние исследования мутагенеза позволили получить значительные успехи в понимании каталитических механизмов и вычитании связывания ГТ.

У бактерий O-гликозилирование, по-видимому, более распространено, чем N-гликозилирование. Участки O-гликозилирования не показывают консенсусной последовательности, и многие из O-гликозилированных белков секретируются или белки клеточной поверхности, такие как жгутики, пили или аутотранспортеры¹. Гликозилирование флагеллина показывает изменчивость в количестве акцепторных участков, составе гликана и структуре. Например, флагеллины Burkholderia spp имеют только один акцепторный участок, в то время как в Campylobacter jejuni жгутики имеют целых 19 акцепторных сайтов^15,16. Кроме того, для некоторых бактерий гликан представляет собой один моносахарид, в то время как другие бактерии обладают гетерогенными гликанами, скомпрометированными различными моносахаридами с образованием олигосахаридов. Такая гетерогенность встречается даже среди штаммов одного вида. Хеликобактерные флагеллины модифицируются только псевдоминовой кислотой (PseAc)¹⁷, а флагеллины Campylobacter могут быть модифицированы PseAc, ацетамидиновой формой псеудаминовой кислоты (PseAm) или легионаминовой кислоты (LegAm), и гликанами, полученными из этих сахаров с ацетилом, N-ацетилглюкозамином или пропионными заменителями ^18,19. В Aeromonas жгутики модифицируются гликанами, состав которых варьируется от одного производного кислоты PseAc до гетерополисахарида²⁰, а присоединение гликанов к мономерам флагеллина всегда происходит через производное PseAc.

В целом, гликозилирование жгутиков имеет важное значение для сборки жгутиковой нити, подвижности, вирулентности и специфичности хозяина. Однако, в то время как флагеллины C. jejuni¹⁶, H. pylori^{17 и} Aeromonas sp. ²¹ не может собираться в нить, если белковые мономеры не являются гликозилированными, Pseudomonas spp. и Burkholderia spp. ¹⁵ не требуют гликозилирования для сборки жгутиков. Кроме того, в некоторых штаммах C. jejuni изменения в сахарном составе жгутикового гликана влияют на взаимодействие бактерий с хозяином и могут играть роль в уклонении от определенных иммунных реакций¹⁶. Аутоагглютинация является еще одной фенотипической характеристикой, на которую влияют изменения в составе гликанов, связанных с жгутиками. Более низкая аутоагглютинация приводит к снижению способности образовывать микроколонии и биопленку²². У некоторых бактерий способность жгутиков вызывать провоспалительную реакцию была связана с жгутиковым гликозилированием. Таким образом, у P. aeruginosa гликозилированный жгутикеллин вызывает более высокую провоспалительную реакцию, чем у негликозилированный²³.

Аэромоны являются грамотрицательными бактериями, повсеместно распространенными в окружающей среде, что позволяет им находиться на стыке всех компонентов One Health ²⁴. Мезофильные аэромоны имеют один полярный жгутик, который конститутивно образуется. Более половины клинических изолятов также экспрессируют боковой флагеллин, индуцируемый в высоковязких средах или пластинах. Различные исследования связывают оба типа жгутиков с ранними стадиями бактериального патогенеза²⁵. В то время как полярные жгутики, о которых сообщалось на сегодняшний день, являются O-гликозилированными при 5-8 Остатках Ser или Thr его центральных иммуногенных доменов, боковые жгутики не являются O-гликозилированными во всех штаммах. Хотя гликаны полярных жгутиков из разных штаммов демонстрируют разнообразие в своем углеводном составе и длине цепи²⁰, было показано, что связывающий сахар является производным псеудаминовой кислоты.

Целью данной рукописи является описание способа получения нулевых мутантов в конкретных ГТ или хромосомных областях, содержащих ГТ, для анализа их участия в биосинтезе соответствующих полисахаридов и в бактериальной патогенности, а также роли самого гликана. В качестве примера мы идентифицируем и удаляем хромосомную область, содержащую GT Aeromonas , чтобы установить ее участие в гликозилировании полярного флагеллина и проанализировать роль гликана флагеллина. Показано, как удалить конкретный ГТ, чтобы установить его функцию в биосинтезе этого гликана и роль модифицированного гликана. Хотя используя Aeromonas в качестве примера, этот принцип может быть использован для идентификации и изучения островов гликозилирования жгутиков других грамотрицательных бактерий и анализа функции GT, участвующих в биосинтезе других гликанов, таких как липополисахарид O-антигена.