Ce protocole présente un flux de travail expérimental complet pour l’étude des interactions ARN-protéine à l’aide de pinces optiques. Plusieurs configurations expérimentales possibles sont décrites, y compris la combinaison de pinces optiques avec la microscopie confocale.
L’ARN adopte divers plis structurels, qui sont essentiels à ses fonctions et peuvent donc avoir un impact sur divers processus dans la cellule. En outre, la structure et la fonction d’un ARN peuvent être modulées par divers facteurs trans-agissants, tels que des protéines, des métabolites ou d’autres ARN. Les molécules d’ARN à décalage de trame, par exemple, sont des ARN régulateurs situés dans des régions codantes, qui dirigent la traduction des ribosomes en un cadre de lecture ouvert alternatif, et agissent ainsi comme des commutateurs de gènes. Ils peuvent également adopter différents plis après s’être liés à des protéines ou à d’autres facteurs trans. Pour disséquer le rôle des protéines de liaison à l’ARN dans la traduction et la façon dont elles modulent la structure et la stabilité de l’ARN, il est crucial d’étudier simultanément l’interaction et les caractéristiques mécaniques de ces complexes ARN-protéine. Ce travail illustre comment utiliser des pinces optiques couplées à une seule molécule et à fluorescence pour explorer le paysage conformationnel et thermodynamique des complexes ARN-protéine à haute résolution. À titre d’exemple, l’interaction de l’élément de décalage de trame ribosomique programmé par le SARS-CoV-2 avec l’isoforme courte du facteur trans-agissant de la protéine antivirale zinc-doigt est élaborée. De plus, les ribosomes marqués par fluorescence ont été surveillés à l’aide de l’unité confocale, ce qui permettrait finalement d’étudier l’allongement de la traduction. Le test OT couplé à la fluorescence peut être largement appliqué pour explorer divers complexes ARN-protéine ou facteurs trans-agissant régulant la traduction et pourrait faciliter les études de la régulation des gènes basée sur l’ARN.
Le transfert de l’information génétique de l’ADN aux protéines à travers les ARNm est un processus biochimique complexe, qui est régulé avec précision à tous les niveaux par des interactions macromoléculaires à l’intérieur des cellules. Pour la régulation translationnelle, les interactions ARN-protéine confèrent un rôle essentiel pour réagir rapidement à divers stimuli et signaux1,2. Certaines interactions ARN-protéine affectent la stabilité de l’ARNm et modifient ainsi le temps pendant lequel un ARN est actif sur le plan translationnel. D’autres interactions ARN-protéine sont associées à des mécanismes de recodage tels que la lecture stop-codon, le contournement ou le décalage de trame ribosomique programmé (PRF)3,4,5,6,7. Récemment, il a été démontré qu’un certain nombre de protéines de liaison à l’ARN (RBP) interagissent avec les éléments de l’ARNm stimulants et la machinerie de traduction pour dicter quand et combien de recodage se produira dans la cellule7,8,9,10,11. Ainsi, pour disséquer le rôle des protéines de liaison à l’ARN dans la traduction et la façon dont elles modulent la structure et la stabilité de l’ARN, il est essentiel d’étudier en détail les principes d’interaction et les propriétés mécaniques de ces complexes ARN-protéine.
Des décennies de travail ont jeté les bases de l’étude du processus de traduction en plusieurs étapes et en plusieurs composants, qui repose sur une communication complexe entre les composants ARN et protéique de la machinerie de traduction pour atteindre la vitesse et la précision12,13,14. Une prochaine étape cruciale dans la compréhension des événements réglementaires complexes consiste à déterminer les forces, les échelles de temps et les déterminants structurels pendant la traduction avec une grande précision12,15,16,17. L’étude de la dynamique conformationnelle de l’ARN et en particulier de la façon dont les facteurs auxiliaires à action trans agissant sur la structure de l’ARN pendant la traduction ont été encore éclairées par l’émergence d’outils à molécule unique, y compris les pinces optiques ou les guides d’ondes en mode zéro16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.
Les pinces optiques (OT) représentent une technique à molécule unique très précise, qui a été appliquée pour étudier de nombreux types de processus dynamiques dépendants de l’ARN, y compris la transcription et la traduction26,27,28,29,30,31,32. L’utilisation de pinces optiques a permis de sonder en détail les interactions moléculaires, les structures des acides nucléiques et les propriétés thermodynamiques, la cinétique et l’énergie de ces processus16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Le test de pince à épiler optique est basé sur le piégeage d’objets microscopiques avec un faisceau laser focalisé. Dans une expérience d’OT typique, la molécule d’intérêt est attachée entre deux billes transparentes (généralement du polystyrène) (Figure 1A)27. Ces perles sont ensuite capturées par des pièges optiques, qui se comportent comme des ressorts. Ainsi, la force appliquée sur la molécule peut être calculée en fonction du déplacement de la perle du centre du faisceau laser focalisé (centre du piège). Récemment, des pinces optiques ont été combinées à la microscopie confocale (Figure 1B), permettant des mesures de fluorescence ou de transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET)40,41,42. Cela ouvre un tout nouveau champ d’expériences possibles permettant une mesure simultanée et, par conséquent, une corrélation précise des données de spectroscopie de force et de fluorescence.
Ici, nous démontrons des expériences utilisant la pince à épiler optique combinée à la microscopie confocale pour étudier les interactions protéine-ARN régulant le décalage translationnel. Entre l’objectif et le condenseur, une cellule d’écoulement à cinq canaux permet une application continue de l’échantillon avec un flux laminaire. Grâce aux canaux microfluidiques, divers composants peuvent être injectés directement, ce qui réduit le temps de pratique et permet très peu de consommation d’échantillons tout au long de l’expérience.
Tout d’abord, une ligne directrice de base pour aider à la conception d’expériences OT est proposée et les avantages ainsi que les pièges de diverses configurations sont discutés. Ensuite, la préparation des échantillons et des flux de travail expérimentaux sont décrits, et un protocole pour l’analyse des données est fourni. Pour représenter un exemple, nous décrivons les résultats obtenus à partir d’expériences d’étirement de l’ARN pour étudier l’élément ARN de décalage de trame du SARS-CoV-2 (Figure 2A) avec le facteur de transaction l’isoforme courte de la protéine antivirale à doigts de zinc (ZAP), qui modifie la traduction de l’ARN viral à partir d’un cadre de lecture alternatif43. En outre, il est démontré que des ribosomes marqués par fluorescence peuvent être utilisés dans ce test confocal OT, ce qui serait utile pour surveiller la processivité et la vitesse de la machine de traduction. La méthode présentée ici peut être utilisée pour tester rapidement l’effet de différents tampons, ligands ou autres composants cellulaires afin d’étudier divers aspects de la traduction. Enfin, les pièges expérimentaux courants et la façon de les résoudre sont discutés. Ci-dessous, quelques points cruciaux de la conception expérimentale sont décrits.
Conception de construction
En principe, il existe deux approches communes pour créer une construction d’ARN compatible OT. La première approche utilise une longue molécule d’ARN qui est hybridée avec des poignées d’ADN complémentaires, donnant ainsi une construction composée de deux régions hybrides ARN/ADN flanquant une séquence d’ARN simple brin au milieu (Figure 2B). Cette approche est utilisée dans la plupart des expériences d’ARN OT33,44,45.
La deuxième approche tire parti des poignées dsDNA avec des porte-à-faux courts (environ 20 nt)15,17. Ces surplombs sont ensuite hybridés avec la molécule d’ARN. Bien que de conception plus compliquée, l’utilisation de poignées dsDNA surmonte certaines des limites du système hybride ADN/ARN. En principe, même des poignées très longues (>10kb) peuvent être mises en œuvre, ce qui est plus pratique pour les mesures confocales. De plus, la molécule d’ARN peut être ligaturée aux poignées d’ADN pour augmenter la stabilité de l’attache.
Stratégie d’étiquetage final
La construction doit être attachée aux perles via une forte interaction moléculaire. Bien qu’il existe des approches disponibles pour la liaison covalente des poignées aux billes46, des interactions fortes mais non covalentes telles que la streptavidine-biotine et la digoxigénine-anticorps sont couramment utilisées dans les expériences OT15,33,35,45. Dans le protocole décrit, la construction est marquée avec de la biotine ou de la digoxigénine, et les billes sont recouvertes de streptavidine ou d’anticorps contre la digoxigénine, respectivement (Figure 1A). Cette approche conviendrait à l’application de forces allant jusqu’à environ 60 pN (par attache)47. De plus, l’utilisation de différentes stratégies d’étiquetage de 5′ et 3′ permet de déterminer l’orientation de l’attache formée entre les perles17.
Marquage des protéines pour les mesures de fluorescence
Pour l’imagerie confocale, il existe plusieurs approches couramment utilisées pour le marquage par fluorescence. Par exemple, les fluorophores peuvent être attachés de manière covalente à des résidus d’acides aminés qui se trouvent nativement dans les protéines ou introduits par mutagénèse dirigée par le site à travers un groupe organique réactif. Les colorants thiol ou réactifs aux amines peuvent être utilisés pour le marquage des résidus de cystéine et de lysine, respectivement. Il existe plusieurs méthodes de protection réversibles pour augmenter la spécificité du marquage48,49, mais les protéines natives seraient généralement marquées à plusieurs résidus. Bien que la petite taille du fluorophore puisse conférer un avantage, un marquage non spécifique peut interférer avec l’activité protéique et, par conséquent, l’intensité du signal peut varier49. En outre, en fonction de l’efficacité de l’étiquetage, l’intensité du signal peut différer d’une expérience à l’autre. Par conséquent, une vérification de l’activité doit être effectuée avant l’expérience.
Dans le cas où la protéine d’intérêt contient une étiquette terminale N ou C, telle qu’une étiquette His ou une étiquette streptococcique, l’étiquetage spécifique de ces étiquettes représente une autre approche populaire. De plus, le marquage ciblé par étiquette réduit le risque que le fluorophore interfère avec l’activité des protéines et peut améliorer la solubilité49. Cependant, l’étiquetage spécifique à l’étiquette donne généralement des protéines marquées monofluorophore, ce qui peut être difficile à détecter. Une autre façon de marquer spécifiquement peut être réalisée en utilisant des anticorps.
Configuration de la microfluidique
La combinaison de l’OT avec un système microfluidique permet une transition rapide entre différentes conditions expérimentales. De plus, les systèmes actuels tirent parti du maintien du flux laminaire à l’intérieur de la cellule d’écoulement, ce qui empêche le mélange de liquides d’autres canaux dans la direction perpendiculaire par rapport à la direction d’écoulement. Par conséquent, l’écoulement laminaire est particulièrement avantageux pour la conception expérimentale. Actuellement, les cellules d’écoulement avec jusqu’à 5 canaux sont couramment utilisées (Figure 3).
Ici, nous démontrons l’utilisation de pinces optiques couplées à la fluorescence pour étudier les interactions et le comportement dynamique des molécules d’ARN avec divers ligands. Ci-dessous, les étapes critiques et les limites de la technique actuelle sont discutées.
Étapes critiques du protocole
Comme pour beaucoup d’autres méthodes, la qualité de l’échantillon est essentielle pour obtenir des données fiables. Par conséquent, pour obtenir des échant…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Anuja Kibe et Jun. Prof. Redmond Smyth d’avoir examiné le manuscrit de manière critique. Nous remercions Tatyana Koch pour son assistance technique experte. Nous remercions Kristyna Pekarkova pour son aide dans l’enregistrement de vidéos expérimentales. Les travaux de notre laboratoire sont soutenus par l’Association Helmholtz et le financement de la subvention Nr. 948636 (à NC) du Conseil européen de la recherche (ERC).
Bacterial Strains | |||
E. coli HB101 | lab collection | N/A | cloning of the vectors |
Chemicals and enzymes | |||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 31424 | Buffers |
Biotin-16-dUTP | Roche | 11093070910 | Biotinylation |
BSA | Sigma-Aldrich | A4737 | Buffers |
Catalase | Lumicks | N/A | Oxygen scavanger system |
Dithiothreitol (DTT) | Melford Labs | D11000 | Buffers |
DNAse I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4527 | in vitro transcription |
dNTPs | Th.Geyer | 11786181 | PCR |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Buffers |
Formamide | Sigma-Aldrich | 11814320001 | Buffers |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | Oxygen scavanger system |
Glucose-oxidase | Lumicks | N/A | Oxygen scavanger system |
HEPES | Carl Roth | HN78.3 | Buffers |
Magnesium chloride | Carl Roth | 2189.1 | Buffers |
Phusion DNA polymerase | NEB | M0530L | Gibson assembly, cloning |
Potassium chloride | Merck | 529552-1KG | Buffers |
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase | Takara Bio Clontech | R050A | PCR |
Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic | NEB | M0296L | in vitro transcription |
RNase Inhibitor | Molox | 1000379515 | Buffers |
rNTPS | life technologies | R0481 | in vitro transcription |
Sodium thiosulophate | Sigma-Aldrich | S6672-500G | Bleach deactivation |
Sytox Green | Lumicks | N/A | confocal measurements |
T4 DNA Polymerase | NEB | M0203S | Biotinylation |
T5 exonuclease | NEB | M0363S | Gibson assembly, cloning |
T7 RNA polymerase | Produced in-house | N/A | in vitro transcription |
Taq DNA polymerase | NEB | M0267S | PCR |
Taq ligase | Biozym | L6060L | Gibson assembly, cloning |
TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P7949 | Buffers |
Kits | |||
Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive) | Nanotemper | MO-L011 | Used for ribosome labeling |
Purefrex 2.0 | GeneFrontier | PF201-0.25-EX | Ribosomes used for the labeling |
Oligonucleotides | |||
5' handle T7 forward | Microsynth | custom order | 5’ – CTTAATACGACTCACTATAGGTC CTTTCTGTGGACGCC – 3’, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1 |
3’ handle reverse | Microsynth | custom order | 5' - GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC – 3', used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1 |
5' handle forward | Microsynth | custom order | 5' – TCCTTTCTGTGGACGCCGC – 3' , used to generate 5' handle in PCR 2 |
5’ handle reverse | Microsynth | custom order | 5’ – CATAAATACCTCTTTACTAATATA TATACCTTCGTAAGCTAGCGT – 3’, used to generate 5' handle in PCR 2 |
3’ handle forward | Microsynth | custom order | 5' – ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC AG – 3', used to generate 3' handle in PCR 3 |
3’ handle reverse 5’labeled with digoxigenin | Microsynth | custom order | 5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC – 3', used to generate 3' handle in PCR 3 |
DNA vectors | |||
pMZ_OT | produced in-house | N/A | further description in "Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control" Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035 |
Software and Algorithms | |||
Atom | https://atom.io/packages/ide-python | N/A | |
Bluelake | Lumicks | N/A | |
Graphpad | https://www.graphpad.com/ | N/A | |
InkScape 0.92.3 | https://inkscape.org/ | N/A | |
Matlab | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | N/A | |
POTATO | https://github.com/lpekarek/POTATO.git | N/A | |
RNAstructure | https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html | N/A | |
Spyder | https://www.spyder-ide.org/ | N/A | |
其他 | |||
Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 µm, 5 ml, 1.0% w/v | Spherotech | SVP-15-5 | |
Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 µm, 2 ml, 0.1% w/v | Spherotech | DIGP-20-2 | |
Syringes | VWR | TERUMO SS+03L1 | |
Devices | |||
C-trap | Lumicks | N/A | optical tweezers coupled with confocal microscopy |