Optisch pincet om RNA-eiwitinteracties in vertaalregelgeving te bestuderen

Overdracht van genetische informatie van DNA naar eiwitten via mRNA’s is een complex biochemisch proces, dat op alle niveaus nauwkeurig wordt gereguleerd door macromoleculaire interacties in cellen. Voor translationele regulatie spelen RNA-eiwitinteracties een cruciale rol om snel te reageren op verschillende stimuli en ^signalen1,2. Sommige RNA-eiwitinteracties beïnvloeden de mRNA-stabiliteit en veranderen daardoor de tijd dat een RNA translatief actief is. Andere RNA-eiwitinteracties zijn geassocieerd met hercoderingsmechanismen zoals stop-codon readthrough, bypassing of geprogrammeerde ribosomale frameshifting (PRF)3,4,5,6,7. Onlangs is aangetoond dat een aantal RNA-bindende eiwitten (RBP’s) interageren met stimulerende mRNA-elementen en de translatiemachinerie om te bepalen wanneer en hoeveel hercodering in de cel zal plaatsvinden7,8,9,10,11. Dus, om de rol van RNA-bindende eiwitten in translatie te ontleden en hoe ze de RNA-structuur en stabiliteit moduleren, is het cruciaal om de interactieprincipes en mechanische eigenschappen van deze RNA-eiwitcomplexen in detail te bestuderen.

Tientallen jaren werk hebben de basis gelegd voor het bestuderen van het meerstaps- en meercomponentenproces van vertaling, dat afhankelijk is van ingewikkelde communicatie tussen het RNA en eiwitcomponenten van de vertaalmachinerie om snelheid en nauwkeurigheid te bereiken12,13,14. Een cruciale volgende stap in het begrijpen van complexe regulerende gebeurtenissen is het bepalen van de krachten, tijdschalen en structurele determinanten tijdens translatie met hoge precisie12,15,16,17. De studie van RNA-conformatiedynamica en vooral hoe trans-acterende hulpfactoren tijdens translatie op de RNA-structuur inwerken, is verder verlicht door de opkomst van hulpmiddelen met één molecuul, waaronder optische pincetten of nulmodusgolfgeleiders16,17,18,19,20,21,22,23,24 ^,25,26.

Optische pincetten (OT) vertegenwoordigen een zeer nauwkeurige single-molecule techniek, die is toegepast om vele soorten RNA-afhankelijke dynamische processen te bestuderen, waaronder transcriptie, en translatie26,27,28,29,30,31,32. Het gebruik van een optisch pincet heeft het mogelijk gemaakt om moleculaire interacties, nucleïnezuurstructuren en thermodynamische eigenschappen, kinetiek en energetica van deze processen in detail te onderzoeken16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Optische pincet assay is gebaseerd op de beknelling van microscopische objecten met een gerichte laserstraal. In een typisch OT-experiment wordt het betreffende molecuul vastgebonden tussen twee transparante (meestal polystyreen) kralen (figuur 1A)²⁷. Deze kralen worden vervolgens gevangen door optische vallen, die zich gedragen als veren. De kracht die op het molecuul wordt uitgeoefend, kan dus worden berekend op basis van de verplaatsing van de kraal uit het midden van de gerichte laserstraal (valcentrum). Onlangs is een optisch pincet gecombineerd met confocale microscopie (figuur 1B), waardoor fluorescentie- of Förster resonantie-energieoverdracht (FRET)-metingen40,41,42 mogelijk zijn. Dit opent een heel nieuw veld van mogelijke experimenten die gelijktijdige meting en dus nauwkeurige correlatie van krachtspectroscopie en fluorescentiegegevens mogelijk maken.

Hier demonstreren we experimenten met behulp van het optische pincet in combinatie met confocale microscopie om eiwit-RNA-interacties te bestuderen die translationele frameshifting reguleren. Tussen het objectief en de condensor maakt een stroomcel met vijf kanalen een continue monstertoepassing met laminaire stroming mogelijk. Via de microfluïdische kanalen kunnen verschillende componenten direct worden geïnjecteerd, wat de hands-on tijd vermindert en zeer weinig monsterverbruik tijdens het experiment mogelijk maakt.

Eerst wordt een basisrichtlijn voorgesteld om het ontwerp van OT-experimenten te ondersteunen en worden voordelen en valkuilen van verschillende opstellingen besproken. Vervolgens wordt de voorbereiding van monsters en experimentele workflows beschreven en wordt een protocol voor de data-analyse verstrekt. Om een voorbeeld te geven, schetsen we de resultaten verkregen van RNA-stretching-experimenten om het SARS-CoV-2 frameshifting RNA-element (figuur 2A) te bestuderen met de trans-acterende factor de korte isovorm van zink-vinger antiviraal eiwit (ZAP), dat de vertaling van het virale RNA van een alternatief leesframe ^verandert43. Bovendien is aangetoond dat fluorescentie-gelabelde ribosomen kunnen worden gebruikt in deze OT confocale assay, wat nuttig zou zijn om de processiviteit en snelheid van de vertaalmachinerie te controleren. De hier gepresenteerde methode kan worden gebruikt om snel het effect van verschillende buffers, liganden of andere cellulaire componenten te testen om verschillende aspecten van translatie te bestuderen. Tot slot worden veelvoorkomende experimentele valkuilen besproken en hoe deze op te lossen. Hieronder worden enkele cruciale punten in experimenteel ontwerp geschetst.

Ontwerp construeren
In principe zijn er twee gangbare benaderingen om een OT-compatibel RNA-construct te maken. De eerste benadering maakt gebruik van een lang RNA-molecuul dat is gehybridiseerd met complementaire DNA-handvatten, waardoor een construct ontstaat dat bestaat uit twee RNA / DNA-hybride regio’s die een enkelstrengs RNA-sequentie in het midden flankeren (figuur 2B). Deze aanpak wordt gebruikt in de meeste OT RNA-experimenten33,44,45.

De tweede benadering maakt gebruik van dsDNA-handgrepen met korte (ongeveer 20 nt) ^{overhangen15,17}. Deze overhangen worden vervolgens gehybridiseerd met het RNA-molecuul. Hoewel ingewikkelder in ontwerp, overwint het gebruik van dsDNA-handles enkele beperkingen van het DNA / RNA-hybride systeem. In principe kunnen zelfs zeer lange handgrepen (>10kb) worden geïmplementeerd, wat handiger is voor confocale metingen. Bovendien kan het RNA-molecuul worden geligeerd aan DNA-handvatten om de stabiliteit van de tether te vergroten.

End-labeling strategie
Het construct moet via een sterke moleculaire interactie aan kralen worden vastgemaakt. Hoewel er benaderingen beschikbaar zijn voor covalente binding van handvatten aan ^kralen46, worden sterke maar niet-covalente interacties zoals streptavidin-biotine en digoxigenine-antilichaam vaak gebruikt in OT-experimenten15,33,35,45. In het beschreven protocol wordt het construct gelabeld met biotine of digoxigenine en zijn de kralen gecoat met respectievelijk streptavidin of antilichamen tegen digoxigenine (figuur 1A). Deze aanpak zou geschikt zijn voor het toepassen van krachten tot ongeveer 60 pN (per tether)⁴⁷. Bovendien maakt het gebruik van verschillende 5′- en 3′-etiketteringsstrategieën het mogelijk om de oriëntatie van de tussen de kralen gevormde ketting te ^bepalen17.

Eiwitetikettering voor fluorescentiemetingen
Voor de confocale beeldvorming zijn er verschillende veelgebruikte benaderingen voor fluorescentie-etikettering. Fluoroforen kunnen bijvoorbeeld covalent worden gehecht aan aminozuurresiduen die inheems in eiwitten worden aangetroffen of door plaatsgerichte mutagenese via een reactieve organische groep worden geïntroduceerd. Thiol of amine-reactieve kleurstoffen kunnen worden gebruikt voor het etiketteren van respectievelijk cysteïne- en lysineresiduen. Er zijn verschillende omkeerbare beschermingsmethoden om de specificiteit van etikettering te ^{vergroten48,49}, maar inheemse eiwitten worden meestal gelabeld op meerdere residuen. Hoewel de kleine omvang van de fluorofoor een voordeel kan bieden, kan niet-specifieke etikettering de eiwitactiviteit verstoren en dus de signaalintensiteit ^variëren49. Afhankelijk van de etikettering kan de intensiteit van het efficiëntiesignaal ook verschillen tussen verschillende experimenten. Daarom moet voorafgaand aan het experiment een activiteitencontrole worden uitgevoerd.

In het geval dat het eiwit van belang een N- of C-terminale tag bevat, zoals een His-tag of streptokokkentag, vertegenwoordigt specifieke etikettering van deze tags een andere populaire benadering. Bovendien vermindert tag-gerichte etikettering de kans dat de fluorofoor de eiwitactiviteit verstoort en kan de oplosbaarheid ^verbeteren49. Tag-specifieke etikettering levert echter meestal mono-fluorofoor gelabelde eiwitten op, die een uitdaging kunnen zijn om te detecteren. Een andere manier van specifieke etikettering kan worden bereikt door antilichamen te gebruiken.

Microfluïdica-installatie
De combinatie van OT met een microfluïdicasysteem maakt een snelle overgang tussen verschillende experimentele omstandigheden mogelijk. Bovendien maken de huidige systemen gebruik van het behoud van de laminaire stroming in de stroomcel, waardoor het mengen van vloeistoffen uit andere kanalen in de loodrechte richting ten opzichte van de stroomrichting wordt uitgesloten. Daarom is laminaire stroming bijzonder voordelig voor het experimentele ontwerp. Momenteel worden vaak flowcellen met maximaal 5 kanalen gebruikt (figuur 3).