Summary

Purificação de Afinidade MS2 juntamente com sequenciamento de RNA em bactérias gram-positivas

Published: February 23, 2021
doi:

Summary

A tecnologia MAPS foi desenvolvida para examinar o targetome de um RNA regulatório específico in vivo. O sRNA de interesse é marcado com um aptamer MS2 permitindo a co-purificação de seus parceiros RNA e sua identificação por sequenciamento de RNA. Este protocolo modificado é particularmente adequado para bactérias Gram-positivas.

Abstract

Embora os PEQUENOs RNAs regulatórios (sRNAs) sejam difundidos entre o domínio bacteriano da vida, as funções de muitos deles permanecem pouco caracterizadas notavelmente devido à dificuldade de identificar seus alvos de mRNA. Aqui, descrevemos um protocolo modificado da Purificação MS2-Affinity, juntamente com a tecnologia RNA Sequencing (MAPS), com o objetivo de revelar todos os parceiros de RNA de um sRNA in vivo específico. Em linhas gerais, o aptamer MS2 é fundido à extremidade de 5′ do sRNA de interesse. Essa construção é então expressa in vivo, permitindo que o MS2-sRNA interaja com seus parceiros celulares. Após a colheita bacteriana, as células são mecanicamente cultivadas. O extrato bruto é carregado em uma coluna de cromatografia à base de amilolose previamente revestida com a proteína MS2 fundida à proteína de ligação maltosa. Isso permite a captura específica de MS2-sRNA e RNAs interagindo. Após a elução, os RNAs co-purificados são identificados por sequenciamento de RNA de alto rendimento e análise bioinformática subsequente. O protocolo a seguir foi implementado no Patógeno Humano Gram-positivo Staphylococcus aureus e é, em princípio, transposável para qualquer bactéria Gram-positiva. Resumindo, a tecnologia MAPS constitui um método eficiente para explorar profundamente a rede regulatória de um sRNA específico, oferecendo um instantâneo de todo o seu targetome. No entanto, é importante ter em mente que as metas putativas identificadas pelo MAPS ainda precisam ser validadas por abordagens experimentais complementares.

Introduction

Centenas, talvez até milhares de pequenas RNAs regulatórias (sRNAs) foram identificadas na maioria dos genomas bacterianos, mas as funções da grande maioria deles permanecem descaracterizadas. No geral, as sRNAs são moléculas curtas sem codificação, desempenhando papéis importantes na fisiologia bacteriana e adaptação a ambientes flutuantes1,2,3. De fato, essas macromoléculas estão no centro de inúmeras redes regulatórias intrincadas, impactando vias metabólicas, respostas ao estresse, mas também virulência e resistência a antibióticos. Logicamente, sua síntese é desencadeada por estímulos ambientais específicos (por exemplo, fome de nutrientes, estresse oxidativo ou membrana). A maioria dos sRNAs regulam mRNAs de alvo múltiplos no nível pós-transcrição através de emparelhamento de base curto e não contíguo. Eles geralmente impedem a iniciação da tradução competindo com ribossomos para as regiões de iniciação de tradução4. A formação de duplexes sRNA:mRNA também frequentemente resulta na degradação ativa do mRNA alvo por meio do recrutamento de RNases específicos.

A caracterização de um targetome sRNA (ou seja, todo o conjunto de suas RNAs alvo) permite a identificação das vias metabólicas nas quais ele intervém e o sinal potencial a que responde. Consequentemente, as funções de um sRNA específico geralmente podem ser inferidas a partir de seu targetome. Para isso, várias ferramentas de previsão de silico foram desenvolvidas, como IntaRNA e CopraRNA5,6,7. Eles notavelmente contam com complementaridade de sequência, emparelhamento de energia e acessibilidade do potencial local de interação para determinar parceiros de sRNA putativos. No entanto, os algoritmos de previsão não integram todos os fatores que influenciam o emparelhamento de base in vivo, como o envolvimento de acompanhantesrna 8 favorecendo interações sub-ideais ou a co-expressão de ambos os parceiros. Devido às suas limitações inerentes, a taxa falsa positiva de ferramentas de predição permanece alta. A maioria das abordagens experimentais em larga escala baseia-se na co-purificação de casais sRNA:mRNA interagindo com uma proteína de ligação de RNA (RBP)6,9. Por exemplo, o método RNA Interaction by Ligation and sequencing (RIL-seq) identificou duplexes RNA co-purificados com acompanhantes de RNA como Hfq e ProQ em Escherichia coli10,11. Uma tecnologia semelhante chamada UV-Crosslinking, Ligation and Sequencing of Hybrids (CLASH) foi aplicada aos SRNAs associados ao RNase E e Hfq em E. coli12,13. Apesar dos papéis bem descritos do Hfq e do ProQ na regulação mediada pelo SRNA em múltiplas bactérias8,14,15, a regulamentação baseada em sRNA parece ser independente de RNA em vários organismos como S. aureus16,17,18. Mesmo que a purificação dos duplexes de RNA em associação com rnases seja viável, como demonstrado por Waters e colegas de trabalho13,isso permanece complicado à medida que as RNases desencadeiam sua rápida degradação. Assim, a Purificação MS2-Affinity juntamente com a abordagem RNA Sequencing (MAPS)19,20 constitui uma alternativa sólida nesses organismos.

Ao contrário dos métodos acima mencionados, o MAPS usa um sRNA específico como isca para capturar todos os RNAs interagindos e, portanto, não depende do envolvimento de um RBP. Todo o processo é retratado na Figura 1. Resumindo, o sRNA é marcado no 5′ com o aptamer MS2 RNA que é especificamente reconhecido pela proteína do casaco MS2. Esta proteína é fundida com a proteína de ligação maltosa (MBP) a ser imobilizada em uma resina de amilose. Portanto, o MS2-sRNA e seus parceiros RNA são mantidos na coluna de cromatografia de afinidade. Após a elução com maltose, os RNAs co-purificados são identificados utilizando-sequenciamento de RNA de alto rendimento seguido de análise bioinformática(Figura 2). A tecnologia MAPS acaba por desenhar um mapa interativo de todas as interações potenciais que ocorrem in vivo.

A tecnologia MAPS foi originalmente implementada na bactéria gram-negativa não patogênica E. coli21. Notavelmente, o MAPS ajudou a identificar um fragmento derivado de tRNA interagindo especificamente com os sRNAs ryhB e RybB e impedindo qualquer ruído transcricional sRNA para regular os alvos de mRNA em condições não indutoras. A partir daí, o MAPS foi aplicado com sucesso a outros E. coli sRNAs como DsrA22, RprA23, CyaR23 e GcvB24 (Tabela 1). Além de confirmar alvos previamente conhecidos, o MAPS estendeu o targetome desses sRNAs conhecidos. Recentemente, o MAPS foi realizado em Salmonella Typhimurium e revelou que o SRNA da SraL se liga ao rho mRNA, codificando para um fator de rescisão de transcrição25. Através deste emparelhamento, a SraL protege rho mRNA da rescisão de transcrição prematura desencadeada pela própria Rho. Curiosamente, essa tecnologia não se restringe aos sRNAs e pode ser aplicada a qualquer tipo de RNAs celular como exemplificado pelo uso de um fragmento derivado de tRNA26 e uma região não traduzida de 5′-untranslated de mRNA22 (Tabela 1).

O método MAPS também foi adaptado à bactéria gram-positiva patogênica S. aureus19. Especificamente, o protocolo de lise foi amplamente modificado para quebrar células eficientemente devido a uma parede celular mais espessa do que as bactérias Gram-negativas e para manter a integridade do RNA. Este protocolo adaptado já desvendou o interactome do RsaA27, RsaI28 e RsaC29. Essa abordagem deu insights sobre o papel crucial dessas sRNAs nos mecanismos regulatórios das propriedades da superfície celular, captação de glicose e respostas ao estresse oxidativo.

O protocolo desenvolvido e implementado em E. coli em 2015 foi recentemente descrito em grande detalhe30. Aqui, fornecemos o protocolo MAPS modificado, que é particularmente adequado para estudar redes reguladoras de sRNA em bactérias Gram-positivas (parede celular mais grossa), sejam elas não patogênicas ou patogênicas (precauções de segurança).

Protocol

1. Buffers e mídia Para experimentos maps, prepare os seguintes buffers e mídia:- Buffer A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl2 e 1 mM DTT)- Buffer E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltose, 0,1% Triton, 1 mM MgCl2 e 1 mM DTT)- Tampão de carregamento de RNA (0,025% cianol de xileno e 0,025% azul bromofenol em 8 M de ureia)- Infundição do Coração Cerebral (BHI) médio (12,5 g de cérebro de bezerro, 10 g de peptone, 5 g de coração de…

Representative Results

Os resultados representativos são originários do estudo do RsaC targetome em S. aureus29. RsaC é um sRNA não convencional de 1.116 nt-long. Seu final de 5′ contém várias regiões repetidas, enquanto seu final de 3′ (544 nt) é estruturalmente independente e contém todos os locais de interação previstos com seus alvos mRNA. A expressão deste sRNA é induzida quando o manganês (Mn) é escasso, o que é frequentemente encontrado no contexto da resposta imune hospedeira. Utilizando…

Discussion

Um protocolo modificado para bactérias Gram-positivas
O protocolo inicial do MAPS foi desenvolvido para estudar o sRNA interactome no organismo modelo E. coli20,30. Aqui, descrevemos um protocolo modificado que é adequado para a caracterização de redes regulatórias dependentes de sRNA no patógeno humano oportunista S. aureus e é certamente transposável para outras bactérias Gram-positivas, patogênicas ou não.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela “Agence Nationale de la Recherche” (ANR, Grant ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH, e ANR-18-CE12-0025-04, CoNoCo, to PR). Também foi publicado sob o âmbito do laboratórioEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 e do ANR-17-EURE-0023 (para RP), como financiamento do Estado administrado pela ANR como parte dos investimentos para o futuro programa. A DL foi apoiada pelo programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia sob o Acordo de Subvenção Marie Skłodowska-Curie nº 753137-SaRNAReg. O trabalho no E. Massé Lab tem sido apoiado por subvenções operacionais dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR), do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) e dos Institutos Nacionais de Saúde NIH Team Grant R01 GM092830-06A1.

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube Sarstedt 72.690.001
15 mL centrifuge tubes Falcon 352070
2 mL microcentrifuge tube Starstedt 72.691
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939BA RNA quantity and quality
250 mL culture flask Dominique Dutscher 2515074 Bacterial cultures
50 mL centrifuge tubes Falcon 352051 Culture centrifugation
Absolute ethanol VWR Chemicals 20821.321 RNA extraction and purification
Allegra X-12R Centrifuge Beckman Coulter Bacterial pelleting
Ampicilin (amp) Sigma-Aldrich A9518-5G Growth medium
Amylose resin New England BioLabs E8021S MS2-affinity purification
Anti-dioxigenin AP Fab fragment Sigma Aldrich 11093274910 Northern blot assays
Autoradiography cassette ThermoFisher Scientific 50-212-726 Northern blot assays
BamHI ThermoFisher Scientific ER0051 Plasmid construction
BHI (Brain Heart Infusion) Broth Sigma-Aldrich 53286 Growth medium
Blocking reagent Sigma Aldrich 11096176001 Northern blot assays
CDP-Star Sigma Aldrich 11759051001 Northern blot assays (substrate)
Centrifuge 5415 R Eppendorf RNA extraction and purification
Chloroform Dominique Dutscher 508320-CER RNA extraction and purification
DIG-RNA labelling mix Sigma-Aldrich 11277073910 Northern blot assays
DNase I Roche 4716728001 DNase treatment
Erythromycin (ery) Sigma-Aldrich Fluka 45673 Growth medium
FastPrep device MP Biomedicals 116004500 Mechanical lysis
Guanidium Thiocyanate Sigma-Aldrich G9277-250G Northern blot assays
Hybridization Hoven Hybrigene Techne FHB4DD Northern blot assays
Hybridization tubes Techne FHB16 Northern blot assays
Isoamyl alcohol Fisher Scientific A/6960/08 RNA extraction and purification
LB (Lysogeny Broth) Sigma-Aldrich L3022 Growth medium
Lysing Matrix B Bulk MP Biomedicals 6540-428 Mechanical lysis
MicroPulser Electroporator BioRad 1652100 Plasmid construction
Milli-Q water device Millipore Z00QSV0WW Ultrapure water
NanoDrop spectrophotometer ThermoFisher Scientific RNA/DNA quantity and quality
Nitrocellulose membrane Dominique Dutsher 10600002 Northern blot assays
Phembact Neutre PHEM Technologies BAC03-5-11205 Cleaning and decontamination
Phenol Carl Roth 38.2 RNA extraction and purification
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530 Plasmid construction
pMBP-MS2 Addgene 65104 MS2-MBP production
Poly-Prep chromatography column BioRad 7311550 MS2-affinity purification
PstI ThermoFisher Scientific ER0615 Plasmid construction
Qubit 3 Fluorometer Invitrogen 15387293 RNA quantity
RNAPro Solution MP Biomedicals 6055050 Mechanical lysis
ScriptSeq Complete Kit Illumina BB1224 Preparation of cDNA librairies
Spectrophotometer Genesys 20 ThermoFisher Scientific 11972278 Bacterial cultures
SpeedVac Savant vacuum device ThermoFisher Scientific DNA120 RNA extraction and purification
Stratalinker UV Crosslinker 1800 Stratagene 400672 Northern blot assays
T4 DNA ligase ThermoFisher Scientific EL0014 Plasmid construction
TBE (Tris-Borate-EDTA) Euromedex ET020-C Northern blot assays
ThermalCycler T100 BioRad 1861096 Plasmid construction
Tween 20 Sigma Aldrich P9416-100ML Northern blot assays
X-ray film processor hu.q HQ-350XT Northern blot assays
X-ray films Super RX-N FujiFilm 4741019318 Northern blot assays

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Mercier, N., Prévost, K., Massé, E., Romby, P., Caldelari, I., Lalaouna, D. MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria. J. Vis. Exp. (168), e61731, doi:10.3791/61731 (2021).

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