Summary

MS2-Affinitätsreinigung gekoppelt mit RNA-Sequenzierung in grampositiven Bakterien

Published: February 23, 2021
doi:

Summary

Die MAPS-Technologie wurde entwickelt, um das Targetom einer bestimmten regulatorischen RNA in vivo zu untersuchen. Die sRNA von Interesse ist mit einem MS2-Aptamer gekennzeichnet, das die Co-Reinigung ihrer RNA-Partner und deren Identifizierung durch RNA-Sequenzierung ermöglicht. Dieses modifizierte Protokoll eignet sich besonders für grampositive Bakterien.

Abstract

Obwohl kleine regulatorische RNAs (sRNAs) im bakteriellen Bereich des Lebens weit verbreitet sind, sind die Funktionen vieler von ihnen nach wie vor schlecht charakterisiert, insbesondere aufgrund der Schwierigkeit, ihre mRNA-Ziele zu identifizieren. Hier beschrieben wir ein modifiziertes Protokoll der MS2-Affinity Purification in Verbindung mit RNA Sequencing (MAPS) Technologie, mit dem Ziel, alle RNA-Partner einer spezifischen sRNA in vivo aufzudecken. Im Großen und Ganzen ist das MS2-Aptamer mit der 5′-Extremität der interessierenden sRNA verschmolzen. Dieses Konstrukt wird dann in vivo exprimiert, so dass die MS2-sRNA mit ihren zellulären Partnern interagieren kann. Nach der Bakterienernte werden die Zellen mechanisch lysiert. Der Rohextrakt wird in eine Amylose-basierte Chromatographiesäule geladen, die zuvor mit dem MS2-Protein beschichtet ist, das mit dem Maltose-bindenden Protein verschmolzen ist. Dies ermöglicht die spezifische Erfassung von MS2-sRNA und interagierenden RNAs. Nach der Elution werden co-gereinigte RNAs durch Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung und anschließende bioinformatische Analyse identifiziert. Das folgende Protokoll wurde im grampositiven Humanpathogen Staphylococcus aureus implementiert und ist prinzipiell auf alle grampositiven Bakterien übertragbar. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die MAPS-Technologie eine effiziente Methode darstellt, um das regulatorische Netzwerk einer bestimmten sRNA gründlich zu erforschen und eine Momentaufnahme ihres gesamten Targetoms zu bieten. Es ist jedoch wichtig zu bedenken, dass die von MAPS identifizierten mutmaßlichen Ziele noch durch komplementäre experimentelle Ansätze validiert werden müssen.

Introduction

Hunderte, vielleicht sogar Tausende von kleinen regulatorischen RNAs (sRNAs) wurden in den meisten bakteriellen Genomen identifiziert, aber die Funktionen der überwiegenden Mehrheit von ihnen bleiben uncharakterisiert. Insgesamt sind sRNAs kurze nicht-kodierende Moleküle, die eine wichtige Rolle in der bakteriellen Physiologie und Anpassung an schwankende Umgebungen spielen1,2,3. Tatsächlich stehen diese Makromoleküle im Zentrum zahlreicher komplizierter regulatorischer Netzwerke, die Stoffwechselwege, Stressreaktionen, aber auch Virulenz und Antibiotikaresistenz beeinflussen. Logischerweise wird ihre Synthese durch spezifische Umweltreize (z.B. Nährstoffmangel, oxidativer oder Membranstress) ausgelöst. Die meisten sRNAs regulieren mehrere Ziel-mRNAs auf posttranskriptioneller Ebene durch kurze und nicht zusammenhängende Basenpaarung. Sie verhindern in der Regel die Translationsinitiierung, indem sie mit Ribosomen um Translationsinitiierungsbereiche konkurrieren4. Die Bildung von sRNA:mRNA-Duplexen führt häufig auch zum aktiven Abbau der Ziel-mRNA durch Rekrutierung spezifischer RNasen.

Die Charakterisierung eines sRNA-Targetoms (d.h. des gesamten Satzes seiner Ziel-RNAs) ermöglicht die Identifizierung der Stoffwechselwege, in die es eingreift, und des potenziellen Signals, auf das es antwortet. Folglich können die Funktionen einer spezifischen sRNA im Allgemeinen aus ihrem Targetom abgeleitet werden. Zu diesem Zweck wurden mehrere in silico Vorhersagewerkzeuge wie IntaRNA und CopraRNA5,6,7entwickelt. Sie stützen sich insbesondere auf Sequenz-Komplementarität, Paarungsenergie und Zugänglichkeit der potenziellen Interaktionsstelle, um mutmaßliche sRNA-Partner zu bestimmen. Vorhersagealgorithmen integrieren jedoch nicht alle Faktoren, die die Basenpaarung in vivo beeinflussen, wie die Beteiligung von RNA-Chaperonen8, die suboptimale Interaktionen begünstigen, oder die Co-Expression beider Partner. Aufgrund ihrer inhärenten Einschränkungen bleibt die Falsch-Positiv-Rate von Vorhersagewerkzeugen hoch. Die meisten experimentellen groß angelegten Ansätze basieren auf der Co-Aufreinigung von sRNA:mRNA-Paaren, die mit einem markierten RNA-bindenden Protein (RBP)interagieren 6,9. Zum Beispiel identifizierte die RIL-seq-Methode (RNA Interaction by Ligation and Sequencing) RNA-Duplexe, die mit RNA-Chaperonen wie Hfq und ProQ in Escherichia coli10,11co-gereinigt wurden. Eine ähnliche Technologie namens UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) wurde auf RNase E- und Hfq-assoziierte sRNAs in E. coli12,13angewendet. Trotz der gut beschriebenen Rolle von Hfq und ProQ bei der sRNA-vermittelten Regulation inmehrerenBakterien8,14,15scheint die sRNA-basierte Regulation in mehreren Organismen wie S. aureus16 , 17,18RNA-Chaperon-unabhängig zu sein . Auch wenn die Aufreinigung von RNA-Duplexen in Verbindung mit RNasen machbar ist, wie Waters und Mitarbeiter13gezeigt haben, bleibt dies schwierig, da RNasen ihren schnellen Abbau auslösen. Daher stellt der MS2-Affinity Purification gekoppelt mit RNA Sequencing (MAPS) Ansatz19,20 eine solide Alternative in solchen Organismen dar.

Im Gegensatz zu den oben genannten Methoden verwendet MAPS eine spezifische sRNA als Köder, um alle interagierenden RNAs zu erfassen, und ist daher nicht auf die Beteiligung eines RBP angewiesen. Der gesamte Prozess ist in Abbildung 1dargestellt. Kurz gesagt, die sRNA wird an der 5′ mit dem MS2-RNA-Aptamer markiert, das spezifisch vom MS2-Mantelprotein erkannt wird. Dieses Protein wird mit dem Maltose-bindenden Protein (MBP) verschmolzen, um auf einem Amyloseharz immobilisiert zu werden. Daher bleiben MS2-sRNA und ihre RNA-Partner auf der Affinitätschromatographiesäule erhalten. Nach der Elution mit Maltose werden co-gereinigte RNAs mittels Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung identifiziert, gefolgt von einer bioinformatischen Analyse (Abbildung 2). Die MAPS-Technologie zeichnet letztendlich eine interagierende Karte aller potenziellen Wechselwirkungen, die in vivo auftreten.

Die MAPS-Technologie wurde ursprünglich im nicht-pathogenen gramnegativen Bakterium E. coli21 implementiert. Bemerkenswerterweise half MAPS dabei, ein tRNA-abgeleitetes Fragment zu identifizieren, das spezifisch mit RyhB- und RybB-sRNAs interagiert und jegliches sRNA-Transkriptionsrauschen verhindert, um mRNA-Ziele unter nicht induzierenden Bedingungen zu regulieren. Danach wurde MAPS erfolgreich auf andere E. coli sRNAs wie DsrA22, RprA23, CyaR23 und GcvB24 angewendet (Tabelle 1). Neben der Bestätigung bisher bekannter Ziele erweiterte MAPS das Targetom dieser bekannten sRNAs. Vor kurzem wurde MAPS in Salmonella Typhimurium durchgeführt und zeigte, dass SraL sRNA an Rho mRNA bindet und für einen Transkriptionsabschlussfaktor25kodiert. Durch diese Paarung schützt SraL rho mRNA vor dem vorzeitigen Transkriptionsabschluss, der durch Rho selbst ausgelöst wird. Interessanterweise ist diese Technologie nicht auf sRNAs beschränkt und kann auf jede Art von zellulären RNAs angewendet werden, wie durch die Verwendung eines tRNA-abgeleiteten Fragments26 und einer 5′-unübersetzten Region von mRNA22 veranschaulicht wird (Tabelle 1).

Die MAPS-Methode wurde auch an das pathogene grampositive Bakterium S. aureus19angepasst. Insbesondere wurde das Lyseprotokoll umfassend modifiziert, um Zellen aufgrund einer dickeren Zellwand als gramnegative Bakterien effizient zu brechen und die RNA-Integrität aufrechtzuerhalten. Dieses angepasste Protokoll entwirrte bereits das Interaktom von RsaA27, RsaI28 und RsaC29. Dieser Ansatz gab Einblicke in die entscheidende Rolle dieser sRNAs bei den Regulationsmechanismen der Zelloberflächeneigenschaften, der Glukoseaufnahme und der oxidativen Stressreaktionen.

Das Protokoll, das 2015 in E. coli entwickelt und implementiert wurde, wurde kürzlich sehr detailliert beschrieben30. Hier stellen wir das modifizierte MAPS-Protokoll zur Verfügung, das sich besonders für die Untersuchung von sRNA-regulatorischen Netzwerken in grampositiven (dickeren Zellwand) Bakterien eignet, ob nicht pathogen oder pathogen (Sicherheitsvorkehrungen).

Protocol

1. Puffer und Medien Bereiten Sie für MAPS-Experimente die folgenden Puffer und Medien vor:- Puffer A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl2 und 1 mM DTT)- Puffer E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM Maltose, 0,1% Triton, 1 mM MgCl2 und 1 mM DTT)- RNA-Ladepuffer (0,025% Xylol cyanol und 0,025% Bromphenolblau in 8 M Harnstoff)- Brain Heart Infusion (BHI) Medium (12,5 g Kälbergehirn, 10 g Pepton, 5 g Rinderherz, 5 g NaCl, 2,5 gNa2HPO<s…

Representative Results

Die repräsentativen Ergebnisse stammen aus der Untersuchung des RsaC-Targetoms in S. aureus29. RsaC ist eine unkonventionelle 1.116 nt-lange sRNA. Sein 5′-Ende enthält mehrere sich wiederholende Regionen, während sein 3′-Ende (544 nt) strukturell unabhängig ist und alle vorhergesagten Interaktionsstellen mit seinen mRNA-Zielen enthält. Die Expression dieser sRNA wird induziert, wenn Mangan (Mn) knapp ist, was häufig im Zusammenhang mit der Immunantwort des Wirts auftritt. Mit hilfe …

Discussion

Ein modifiziertes Protokoll für grampositive Bakterien
Das ursprüngliche Protokoll von MAPS wurde entwickelt, um das sRNA-Interkotom im Modellorganismus E. coli20,30zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein modifiziertes Protokoll, das sich zur Charakterisierung von sRNA-abhängigen regulatorischen Netzwerken im opportunistischen Humanpathogen S. aureus eignet und durchaus auf andere grampositive Bakterien, pathogen oder nic…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der “Agence Nationale de la Recherche” (ANR, Grant ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH und ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, to PR) unterstützt. Es wurde auch im Rahmen der labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 und von ANR-17-EURE-0023 (to PR) als Finanzierung durch den von ANR verwalteten Staat im Rahmen der Investitionen für das Zukunftsprogramm veröffentlicht. DL wurde durch das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skłodowska-Curie-Finanzhilfevereinbarung Nr. 753137-SaRNAReg unterstützt. Die Arbeit im E. Massé Lab wurde durch Betriebskostenzuschüsse der Canadian Institutes of Health Research (CIHR), des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) und des National Institutes of Health NIH Team Grant R01 GM092830-06A1 unterstützt.

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube Sarstedt 72.690.001
15 mL centrifuge tubes Falcon 352070
2 mL microcentrifuge tube Starstedt 72.691
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939BA RNA quantity and quality
250 mL culture flask Dominique Dutscher 2515074 Bacterial cultures
50 mL centrifuge tubes Falcon 352051 Culture centrifugation
Absolute ethanol VWR Chemicals 20821.321 RNA extraction and purification
Allegra X-12R Centrifuge Beckman Coulter Bacterial pelleting
Ampicilin (amp) Sigma-Aldrich A9518-5G Growth medium
Amylose resin New England BioLabs E8021S MS2-affinity purification
Anti-dioxigenin AP Fab fragment Sigma Aldrich 11093274910 Northern blot assays
Autoradiography cassette ThermoFisher Scientific 50-212-726 Northern blot assays
BamHI ThermoFisher Scientific ER0051 Plasmid construction
BHI (Brain Heart Infusion) Broth Sigma-Aldrich 53286 Growth medium
Blocking reagent Sigma Aldrich 11096176001 Northern blot assays
CDP-Star Sigma Aldrich 11759051001 Northern blot assays (substrate)
Centrifuge 5415 R Eppendorf RNA extraction and purification
Chloroform Dominique Dutscher 508320-CER RNA extraction and purification
DIG-RNA labelling mix Sigma-Aldrich 11277073910 Northern blot assays
DNase I Roche 4716728001 DNase treatment
Erythromycin (ery) Sigma-Aldrich Fluka 45673 Growth medium
FastPrep device MP Biomedicals 116004500 Mechanical lysis
Guanidium Thiocyanate Sigma-Aldrich G9277-250G Northern blot assays
Hybridization Hoven Hybrigene Techne FHB4DD Northern blot assays
Hybridization tubes Techne FHB16 Northern blot assays
Isoamyl alcohol Fisher Scientific A/6960/08 RNA extraction and purification
LB (Lysogeny Broth) Sigma-Aldrich L3022 Growth medium
Lysing Matrix B Bulk MP Biomedicals 6540-428 Mechanical lysis
MicroPulser Electroporator BioRad 1652100 Plasmid construction
Milli-Q water device Millipore Z00QSV0WW Ultrapure water
NanoDrop spectrophotometer ThermoFisher Scientific RNA/DNA quantity and quality
Nitrocellulose membrane Dominique Dutsher 10600002 Northern blot assays
Phembact Neutre PHEM Technologies BAC03-5-11205 Cleaning and decontamination
Phenol Carl Roth 38.2 RNA extraction and purification
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530 Plasmid construction
pMBP-MS2 Addgene 65104 MS2-MBP production
Poly-Prep chromatography column BioRad 7311550 MS2-affinity purification
PstI ThermoFisher Scientific ER0615 Plasmid construction
Qubit 3 Fluorometer Invitrogen 15387293 RNA quantity
RNAPro Solution MP Biomedicals 6055050 Mechanical lysis
ScriptSeq Complete Kit Illumina BB1224 Preparation of cDNA librairies
Spectrophotometer Genesys 20 ThermoFisher Scientific 11972278 Bacterial cultures
SpeedVac Savant vacuum device ThermoFisher Scientific DNA120 RNA extraction and purification
Stratalinker UV Crosslinker 1800 Stratagene 400672 Northern blot assays
T4 DNA ligase ThermoFisher Scientific EL0014 Plasmid construction
TBE (Tris-Borate-EDTA) Euromedex ET020-C Northern blot assays
ThermalCycler T100 BioRad 1861096 Plasmid construction
Tween 20 Sigma Aldrich P9416-100ML Northern blot assays
X-ray film processor hu.q HQ-350XT Northern blot assays
X-ray films Super RX-N FujiFilm 4741019318 Northern blot assays

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Mercier, N., Prévost, K., Massé, E., Romby, P., Caldelari, I., Lalaouna, D. MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria. J. Vis. Exp. (168), e61731, doi:10.3791/61731 (2021).

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