Summary

Purification par affinité MS2 couplée au séquençage de l’ARN dans les bactéries à Gram positif

Published: February 23, 2021
doi:

Summary

La technologie MAPS a été développée pour examiner le targetome d’un ARN régulateur spécifique in vivo. L’ARN d’intérêt est marqué à l’aide d’un aptamère MS2 permettant la co-purification de ses partenaires ARN et leur identification par séquençage de l’ARN. Ce protocole modifié est particulièrement adapté aux bactéries à Gram positif.

Abstract

Bien que les petits ARN régulateurs (ARNs) soient répandus dans le domaine bactérien de la vie, les fonctions de beaucoup d’entre eux restent mal caractérisées notamment en raison de la difficulté d’identifier leurs cibles d’ARNm. Ici, nous avons décrit un protocole modifié de la purification par affinité MS2 couplé à la technologie de séquençage de l’ARN (MAPS), visant à révéler tous les partenaires ARN d’un ARN spécifique in vivo. En gros, l’aptamère MS2 est fusionné à l’extrémité 5′ de l’ARNr d’intérêt. Cette construction est ensuite exprimée in vivo, permettant à l’ARNsM2 d’interagir avec ses partenaires cellulaires. Après la récolte bactérienne, les cellules sont lysées mécaniquement. L’extrait brut est chargé dans une colonne de chromatographie à base d’amylose préalablement recouverte de la protéine MS2 fusionnée à la protéine de liaison au maltose. Cela permet la capture spécifique de l’ARNs MS2 et des ARN en interaction. Après l’élution, les ARN co-purifiés sont identifiés par séquençage de l’ARN à haut débit et analyse bioinformatique ultérieure. Le protocole suivant a été mis en œuvre dans l’agent pathogène humain à Gram positif Staphylococcus aureus et est, en principe, transposable à toute bactérie à Gram positif. En résumé, la technologie MAPS constitue une méthode efficace pour explorer en profondeur le réseau de régulation d’un ARNr particulier, offrant un instantané de l’ensemble de son targetome. Cependant, il est important de garder à l’esprit que les cibles putatives identifiées par MAPS doivent encore être validées par des approches expérimentales complémentaires.

Introduction

Des centaines, voire des milliers de petits ARN régulateurs (ARNs) ont été identifiés dans la plupart des génomes bactériens, mais les fonctions de la grande majorité d’entre eux restent inhabituelles. Dans l’ensemble, les ARNs sont de courtes molécules non codantes, jouant un rôle majeur dans la physiologie bactérienne et l’adaptation aux environnements fluctuants1,2,3. En effet, ces macromolécules sont au centre de nombreux réseaux de régulation complexes, impactant les voies métaboliques, les réponses au stress mais aussi la virulence et la résistance aux antibiotiques. Logiquement, leur synthèse est déclenchée par des stimuli environnementaux spécifiques (p. ex. privation de nutriments, stress oxydatif ou membranaire). La plupart des ARNm régulent plusieurs ARNm cibles au niveau post-transcriptionnel par le biais d’appariements de bases courts et non contigus. Ils empêchent généralement l’initiation de la traduction en concurrençant les ribosomes pour les régions d’initiation de la traduction4. La formation de duplex ARNm:ARNm entraîne aussi souvent la dégradation active de l’ARNm cible par le recrutement de RNases spécifiques.

La caractérisation d’un targetome d’ARNs (c’est-à-dire l’ensemble de ses ARN cibles) permet d’identifier les voies métaboliques dans lesquelles il intervient et le signal potentiel auquel il répond. Par conséquent, les fonctions d’un ARNr spécifique peuvent généralement être déduites de son targetome. A cet effet, plusieurs outils de prédiction in silico ont été développés tels que IntaRNA et CopraRNA5,6,7. Ils s’appuient notamment sur la complémentarité des séquences, l’énergie d’appariement et l’accessibilité du site d’interaction potentiel pour déterminer les partenaires d’ARNs putatifs. Cependant, les algorithmes de prédiction n’intègrent pas tous les facteurs influençant l’appariement de bases in vivo tels que l’implication d’ARN chaperons8 favorisant des interactions sous-optimales ou la co-expression des deux partenaires. En raison de leurs limites inhérentes, le taux de faux positifs des outils de prédiction reste élevé. La plupart des approches expérimentales à grande échelle sont basées sur la co-purification des couples ARNs:ARNm interagissant avec une protéine de liaison à l’ARN marqué (RBP)6,9. Par exemple, la méthode RNA Interaction by Ligation and sequencing (RIL-seq) a identifié des duplex d’ARN co-purifiés avec des chaperons d’ARN tels que Hfq et ProQ dans Escherichia coli10,11. Une technologie similaire appelée UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) a été appliquée aux ARNs associés à la RNase E- et Hfq dans E. coli12,13. Malgré les rôles bien décrits de Hfq et ProQ dans la régulation par l’ARN dans plusieurs bactéries8,14,15,la régulation basée sur l’ARNs semble être indépendante de l’ARN chez plusieurs organismes comme S. aureus16,17,18. Même si la purification des duplex d’ARN en association avec les RNases est possible comme démontré par Waters et ses collègues13,cela reste délicat car les RNases déclenchent leur dégradation rapide. Par conséquent, l’approche MS2-Affinity Purification couplée au Séquençage de l’ARN (MAPS)19,20 constitue une alternative solide chez de tels organismes.

Contrairement aux méthodes mentionnées ci-dessus, MAPS utilise un ARN spécifique comme appât pour capturer tous les ARN en interaction et ne repose donc pas sur l’implication d’un RBP. L’ensemble du processus est illustré à la figure 1. En bref, l’ARNs est marqué au 5′ avec l’aptamère à ARN MS2 qui est spécifiquement reconnu par la protéine ms2. Cette protéine est fusionnée avec la protéine de liaison au maltose (MBP) pour être immobilisée sur une résine amylose. Par conséquent, l’ARNsM2 et ses partenaires ARN sont retenus sur la colonne de chromatographie d’affinité. Après élution avec du maltose, les ARN co-purifiés sont identifiés à l’aide d’un séquençage d’ARN à haut débit suivi d’une analyse bioinformatique(Figure 2). La technologie MAPS dessine finalement une carte en interaction de toutes les interactions potentielles se produisant in vivo.

La technologie MAPS a été mise en œuvre à l’origine dans la bactérie Gram négatif non pathogène E. coli21. Remarquablement, MAPS a aidé à identifier un fragment dérivé de l’ARNt interagissant spécifiquement avec les ARNs RyhB et RybB et empêchant tout bruit transcriptionnel de l’ARNr pour réguler les cibles de l’ARNm dans des conditions non induisantes. Par la suite, maps a été appliqué avec succès à d’autres ARNs de E. coli comme DsrA22,RprA23,CyaR23 et GcvB24 (Tableau 1). En plus de confirmer des cibles précédemment connues, MAPS a étendu le targetome de ces ARNs bien connus. Récemment, MAPS a été réalisée dans Salmonella Typhimurium et a révélé que l’ARNs SraL se lie à l’ARNm rho, codant pour un facteur de terminaison de transcription25. Grâce à cet appariement, SraL protège l’ARNm rho de l’arrêt prématuré de la transcription déclenché par Rho lui-même. Fait intéressant, cette technologie n’est pas limitée aux ARNs et peut être appliquée à n’importe quel type d’ARN cellulaires comme l’illustre l’utilisation d’un fragment dérivé de l’ARNt26 et d’une région non traduite 5′-de l’ARNm22 (Tableau 1).

La méthode MAPS a également été adaptée à la bactérie pathogène à Gram positif S. aureus19. Plus précisément, le protocole de lyse a été largement modifié pour briser efficacement les cellules en raison d’une paroi cellulaire plus épaisse que les bactéries à Gram négatif et pour maintenir l’intégrité de l’ARN. Ce protocole adapté a déjà démêlé l’interactome de RsaA27,RsaI28 et RsaC29. Cette approche a donné des aperçus sur le rôle crucial de ces ARNs dans les mécanismes de régulation des propriétés de surface cellulaire, de l’absorption de glucose, et des réponses oxydantes de stress.

Le protocole élaboré et mis en œuvre dans E. coli en 2015 a récemment été décrit en détail30. Ici, nous fournissons le protocole MAPS modifié, qui est particulièrement adapté à l’étude des réseaux de régulation de l’ARNs chez les bactéries Gram-positives (paroi cellulaire plus épaisse), qu’elles soient non pathogènes ou pathogènes (précautions de sécurité).

Protocol

1. Tampons et supports Pour les expériences MAPS, préparez les mémoires tampons et les supports suivants :- Tampon A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl2 et 1 mM TNT)- Tampon E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltose, 0,1 % Triton, 1 mM MgCl2 et 1 mM TNT)- Tampon de charge d’ARN (0,025 % de cyanol de xylène et 0,025 % de bleu de bromophénol dans l’urée 8 M)- Brain Heart Infusion (BHI) milieu (12,5 g de cerveau de veau, 10 g de pept…

Representative Results

Les résultats représentatifs proviennent de l’étude du targetome RsaC chez S. aureus29. RsaC est un ARNs 1,116 nt-long non conventionnel. Son extrémité 5′ contient plusieurs régions répétées tandis que son extrémité 3′ (544 nt) est structurellement indépendante et contient tous les sites d’interaction prédits avec ses cibles ARNm. L’expression de cet ARNs est induite lorsque le manganèse (Mn) est rare, ce qui est souvent produit dans le contexte de la réponse immunita…

Discussion

Un protocole modifié pour les bactéries à Gram positif
Le protocole initial de MAPS a été développé pour étudier l’interactome de l’ARNs dans l’organisme modèle E. coli20,30. Ici, nous décrivons un protocole modifié qui convient à la caractérisation des réseaux de régulation ARN-dépendants dans l’agent pathogène humain opportuniste S. aureus et est certainement transposable à d’autres bactéries Gr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux ont été soutenus par l’Agence Nationale de la Recherche (ANR, Subvention ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH, et ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, à PR). Il a également été publié dans le cadre du labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 et de l’ANR-17-EURE- 0023 (à PR), en tant que financement de l’État géré par ANR dans le cadre des investissements pour le futur programme. DL a été soutenu par le programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention Marie Skłodowska-Curie n° 753137-SaRNAReg. Les travaux du laboratoire E. Massé ont été appuyés par des subventions de fonctionnement des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) et de la subvention d’équipe R01 GM092830-06A1 des NIH des National Institutes of Health.

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube Sarstedt 72.690.001
15 mL centrifuge tubes Falcon 352070
2 mL microcentrifuge tube Starstedt 72.691
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939BA RNA quantity and quality
250 mL culture flask Dominique Dutscher 2515074 Bacterial cultures
50 mL centrifuge tubes Falcon 352051 Culture centrifugation
Absolute ethanol VWR Chemicals 20821.321 RNA extraction and purification
Allegra X-12R Centrifuge Beckman Coulter Bacterial pelleting
Ampicilin (amp) Sigma-Aldrich A9518-5G Growth medium
Amylose resin New England BioLabs E8021S MS2-affinity purification
Anti-dioxigenin AP Fab fragment Sigma Aldrich 11093274910 Northern blot assays
Autoradiography cassette ThermoFisher Scientific 50-212-726 Northern blot assays
BamHI ThermoFisher Scientific ER0051 Plasmid construction
BHI (Brain Heart Infusion) Broth Sigma-Aldrich 53286 Growth medium
Blocking reagent Sigma Aldrich 11096176001 Northern blot assays
CDP-Star Sigma Aldrich 11759051001 Northern blot assays (substrate)
Centrifuge 5415 R Eppendorf RNA extraction and purification
Chloroform Dominique Dutscher 508320-CER RNA extraction and purification
DIG-RNA labelling mix Sigma-Aldrich 11277073910 Northern blot assays
DNase I Roche 4716728001 DNase treatment
Erythromycin (ery) Sigma-Aldrich Fluka 45673 Growth medium
FastPrep device MP Biomedicals 116004500 Mechanical lysis
Guanidium Thiocyanate Sigma-Aldrich G9277-250G Northern blot assays
Hybridization Hoven Hybrigene Techne FHB4DD Northern blot assays
Hybridization tubes Techne FHB16 Northern blot assays
Isoamyl alcohol Fisher Scientific A/6960/08 RNA extraction and purification
LB (Lysogeny Broth) Sigma-Aldrich L3022 Growth medium
Lysing Matrix B Bulk MP Biomedicals 6540-428 Mechanical lysis
MicroPulser Electroporator BioRad 1652100 Plasmid construction
Milli-Q water device Millipore Z00QSV0WW Ultrapure water
NanoDrop spectrophotometer ThermoFisher Scientific RNA/DNA quantity and quality
Nitrocellulose membrane Dominique Dutsher 10600002 Northern blot assays
Phembact Neutre PHEM Technologies BAC03-5-11205 Cleaning and decontamination
Phenol Carl Roth 38.2 RNA extraction and purification
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530 Plasmid construction
pMBP-MS2 Addgene 65104 MS2-MBP production
Poly-Prep chromatography column BioRad 7311550 MS2-affinity purification
PstI ThermoFisher Scientific ER0615 Plasmid construction
Qubit 3 Fluorometer Invitrogen 15387293 RNA quantity
RNAPro Solution MP Biomedicals 6055050 Mechanical lysis
ScriptSeq Complete Kit Illumina BB1224 Preparation of cDNA librairies
Spectrophotometer Genesys 20 ThermoFisher Scientific 11972278 Bacterial cultures
SpeedVac Savant vacuum device ThermoFisher Scientific DNA120 RNA extraction and purification
Stratalinker UV Crosslinker 1800 Stratagene 400672 Northern blot assays
T4 DNA ligase ThermoFisher Scientific EL0014 Plasmid construction
TBE (Tris-Borate-EDTA) Euromedex ET020-C Northern blot assays
ThermalCycler T100 BioRad 1861096 Plasmid construction
Tween 20 Sigma Aldrich P9416-100ML Northern blot assays
X-ray film processor hu.q HQ-350XT Northern blot assays
X-ray films Super RX-N FujiFilm 4741019318 Northern blot assays

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Mercier, N., Prévost, K., Massé, E., Romby, P., Caldelari, I., Lalaouna, D. MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria. J. Vis. Exp. (168), e61731, doi:10.3791/61731 (2021).

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