Summary

Detección de Phytophthora capsici en agua de riego mediante amplificación isotérmica mediada por bucle

Published: June 25, 2020
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Summary

Desarrollamos un método para detectar zoosporas phytophthora capsici en fuentes de agua utilizando un método de extracción de ADN de papel de filtro junto con un ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) que se puede analizar en el campo o en el laboratorio.

Abstract

Phytophthora capsici es un patógeno oomiceto devastador que afecta a muchos cultivos importantes solanáceos y cucurbitos que causan pérdidas económicas significativas en la producción de hortalizas anualmente. Phytophthora capsici es transmitido por el suelo y un problema persistente en los campos vegetales debido a sus estructuras de supervivencia de larga duración (oosporas y clamidosporas) que resisten la intemperie y la degradación. El principal método de dispersión es a través de la producción de zoosporas, que son esporas unicelulares y flageladas que pueden nadar a través de finas películas de agua presentes en superficies o en poros de suelo llenos de agua y pueden acumularse en charcos y estanques. Por lo tanto, los estanques de riego pueden ser una fuente del patógeno y los puntos iniciales de los brotes de enfermedades. La detección de P. capsici en el agua de riego es difícil utilizando métodos tradicionales basados en el cultivo porque otros microorganismos presentes en el medio ambiente, como Pythium spp., generalmente el crecimiento excesivo de P. capsici lo hacen indetectable. Para determinar la presencia de esporas de P. capsici en fuentes de agua (agua de riego, escorrentía, etc.), desarrollamos un método de filtro a base de bomba manual (8-10 m) que captura las esporas del patógeno (zoosporas) y más tarde se utiliza para amplificar el ADN del patógeno a través de un nuevo ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) como ensayo diseñado para la amplificación específica de P. Este método puede amplificar y detectar el ADN a partir de una concentración tan baja como 1,2 x 102 zoosporas/ml, que es 40 veces más sensible que la PCR convencional. No se obtuvo amplificación cruzada al probar especies estrechamente relacionadas. LAMP también se realizó utilizando un tinte de mezcla maestro LAMP colorimétrico, mostrando resultados que se podían leer a simple vista para la detección rápida in situ. Este protocolo podría adaptarse a otros patógenos que residen, se acumulan o se dispersan a través de sistemas de riego contaminados.

Introduction

El reciclaje de agua en granjas y viveros se está volviendo cada vez más popular debido al aumento de los costos de agua y las preocupaciones ambientales detrás del uso del agua. Se han desarrollado muchos métodos de riego para los cultivadores para reducir la propagación y la aparición de enfermedades de las plantas. Independientemente de la fuente del agua (irrigación o precipitación), se genera escorrentía, y muchos cultivadores de hortalizas y viveros tienen un estanque para recoger y reciclar la escorrentía1. Esto crea un reservorio para una posible acumulación de patógenos favoreciendo la propagación de patógenos cuando el agua reciclada se utiliza para regar cultivos2,3,4. Los patógenos de las plantas de oomycete se benefician particularmente de esta práctica, ya que las zoosporas se acumularán en el agua y la espora dispersiva primaria es automotilo pero requiere agua superficial5,,6,,7. Phytophthora capsici es un patógeno oomiceto que afecta a un número significativo de cultivos solanáceos y cucuridos de diferentes maneras8. A menudo, los síntomas son amortiguación de las plántulas, la pudrición de la raíz y la corona; sin embargo, en cultivos como el pepino, la calabaza, el melón, la calabaza, la sandía, la berenjena y la pimienta, las cosechas enteras pueden perderse debido a la putrefacción de la fruta9. Aunque existen métodos conocidos para detectar este patógeno vegetal, la mayoría requieren que ya se haya producido una infección que es demasiado tarde para que los fungicidas preventivos tengan un efecto significativo10.

El método tradicional para probar el agua de riego para la detección y diagnóstico de microorganismos específicos es un enfoque anticuado cuando la velocidad y la sensibilidad son cruciales para el éxito y la producción rentable de cultivos11,,12. El tejido vegetal susceptible al patógeno objetivo (por ejemplo, la berenjena para P. capsici)se une a una trampa modificada que se suspende en un estanque de riego durante un período prolongado antes de ser retirada e inspeccionada en busca de infección. Las muestras del tejido vegetal se chapan en medios semies selectivos (PARPH) y se incuban para el crecimiento del cultivo, luego la identificación morfológica se realiza utilizando un microscopio compuesto13. Existen otros métodos de detección similares para otros patógenos vegetales que utilizan medios selectivos y enchapar pequeñas cantidades de agua contaminada antes del sub-cultivo14,15. Estos métodos requieren entre 2 y 6 semanas, varias rondas de sub-cultivo para aislar el organismo, y experiencia en diagnóstico Phytophthora para ser capaz de reconocer los caracteres morfológicos clave de cada especie. Estos métodos tradicionales no funcionan bien para la detección de agua de riego contaminada por P. capsici debido a factores como la interferencia de otros microorganismos que también están presentes en las fuentes de agua. Algunos microorganismos de rápido crecimiento como Pythium spp. y las bacterias transmitidas por el agua pueden crecer en exceso en la placa haciendo que P. capsici no sea detectable16,17.

El propósito de este estudio fue desarrollar un método molecular sensible y específico que se pueda utilizar tanto en entornos de campo como de laboratorio para detectar las zoosporas P. capsici en el agua de riego. El protocolo incluye el desarrollo de un novedoso conjunto de imprimación de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) capaz de amplificar específicamente P. capsici,basado en un fragmento de par de 1121 bases (bp) de P. capsici18,,19. (2015) se utilizó una imprimación LAMP previamente desarrollada de Dong et al. (2015) en comparación con el ensayo que se desarrolló para este estudio20.

El ensayo LAMP es una forma relativamente nueva de detección molecular que se ha demostrado que es más rápida, sensible y específica que la reacción en cadena de la polimerasa convencional (PCR)21. En general, los ensayos de PCR convencionales no pueden detectar menos de 500 copias (1,25 pg/L); por el contrario, estudios anteriores han demostrado que la sensibilidad de LAMP puede ser de 10 a 1.000 veces mayor que la PCR convencional y puede detectar fácilmente incluso 1 fg/L de ADN genómico22,,23. Además, el ensayo se puede llevar a cabo rápidamente (a menudo en 30 minutos) y in situ (en el campo) mediante el uso de un bloque de calentamiento portátil para la amplificación y un tinte colorimétrico que cambia de color para una muestra positiva (eliminando la necesidad de electroforesis). En este estudio, comparamos la sensibilidad de los ensayos de PCR y LAMP utilizando un método de extracción de filtros. El método de detección propuesto permite a los investigadores y agentes de extensión detectar fácilmente la presencia de esporas de P. capsici de diferentes fuentes de agua en menos de dos horas. El ensayo ha demostrado ser más sensible que el PCR convencional y se validó in situ mediante la detección de la presencia del patógeno en el agua de riego utilizada por un cultivador. Este método de detección permitirá a los cultivadores estimar la presencia y densidad de población del patógeno en diversas fuentes de agua que se utilizan para el riego, evitando brotes devastadores y pérdidas económicas.

Protocol

1. Detección in situ de Phytophthora capsici del agua de riego utilizando amplificación isotérmica mediada por bucle portátil Configuración de la bomba y el filtro Coloque un matraz filtrante en un tubo que esté conectado a una bomba de mano para que cuando se active la bomba, se extraiga aire a través de la boca del matraz de filtrado. Coloque el embudo Buchner en el tapón de goma en la boca del matraz filtrante y coloque la pieza de papel de filtro del tamaño adecuado en e…

Representative Results

Optimización del método LAMPEn este estudio, detectamos la presencia de Phytophthora capsici en el agua de riego utilizando un ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle portátil (LAMP). En primer lugar, el ensayo LAMP propuesto se optimizó probando diferentes concentraciones de imprimación LAMP [F3, B3 (0,1–0,5 oM cada una); LF, LB (0,5–1,0 M cada uno) y FIP, BIP (0,8–2,4 m cada uno)], duraciones (30–70 min) y temperaturas (55–70 oC). La mezcla final de imprimaci?…

Discussion

La prueba de agua de riego para fitopatógenos es un paso crucial para los cultivadores que utilizan estanques de riego y agua reciclada27. Los estanques de riego proporcionan un reservorio y caldo de cultivo para una serie de fitopatógenos, ya que el exceso de agua de riego se dirige desde el campo hasta el estanque que lleva consigo cualquier patógeno que pueda haber estado presente16,,27. El método tradicional para la detección de p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo recibió el apoyo financiero del proyecto de la Comisión de Productos Básicos de Georgia para Hortalizas, ID, FP00016659. Los autores agradecen a la Dra. Pingsheng Ji, Universidad de Georgia y Dra. Anne Dorrance, Universidad Estatal de Ohio por proporcionar culturas puras de Phytophthora spp. También agradecemos a Li Wang y Deloris Veney por su asistencia técnica durante todo el estudio.

Materials

Agarose gel powder Thomas Scientific C997J85
Buchner funnel Southern Labware JBF003
Bullet Blender Next Advance BBX24
Centrifuge 5430 Eppendorf 22620509
Chloroform Fischer Scientific C298-500
CTAB solution Biosciences 786-565
Dneasy Extraction Kit Qiagen 69104
Filter Flask United FHFL1000
Filter Paper United Scientific Supplies FPR009
Gel Green 10000X Thomas Scientific B003B68 (1/EA)
Genie III OptiGene
Hand pump Thomas Scientific 1163B06
Iso-amyl Alcohol Fischer Scientific BP1150-500
LAVA LAMP master mix Lucigen 30086-1
Magnetic bead DNA extraction Genesig genesigEASY-EK
Magnetic Separator Genesig genesigEASY-MR
polyvinylpyrrolidone Sigma Aldrich PVP40-500G
Primers Sigma Aldrich
Prism Mini Centrifuge Labnet C1801
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
UV Gel Doc Analytik Jena 849-00502-2
Warmstart Colorimetric Dye Lucigen E1800m
Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell Bio-Rad 1704489EDU
70% isopropanol Fischer Scientific A451-1

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Hudson, O., Waliullah, S., Hand, J., Gazis-Seregina, R., Baysal-Gurel, F., Ali, M. E. Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification. J. Vis. Exp. (160), e61478, doi:10.3791/61478 (2020).

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