루프 매개 이소르말 증폭을 사용하여 관개물에서 피토프토라 캡시 검출
Summary
현장이나 실험실에서 분석할 수 있는 루프 매개 이더스말 증폭(LAMP) 분석과 결합된 필터 종이 DNA 추출 방법을 사용하여 수원에서 피토프토라 캡시 동물원을 검출하는 방법을 개발했습니다.
Abstract
Phytophthora capsici는 매년 야채 생산에 상당한 경제적 손실을 일으키는 많은 중요 한 솔 라 와 cucurbit 작물에 영향을 미치는 파괴적인 oomycete 병원 체 병원 체. 식물성 캡시치는 풍화와 저하에 저항하는 오랜 생존 구조 (oospores 및 클라미도스포레스)로 인해 토양 매개 및 식물 분야에서 지속적인 문제입니다. 분산의 주요 방법은 표면이나 물로 채워진 토양 모공에서 존재하는 얇은 필름을 통해 수영할 수 있고 웅덩이와 연못에 축적 될 수있는 단일 세포, 기화 포자의 생산을 통해입니다. 따라서 관개 연못은 병원체및 질병 발생의 초기 지점의 원천이 될 수 있다. 피티움 스PP와 같은 환경에 존재하는 다른 미생물이 일반적으로 P. capsici를 과도하게 성장시켜 검출할 수 없기 때문에 관개 물에서 P. capsici를 검출하는 것은 전통적인 배양 기반 방법을 사용하기 어렵다. P의 존재를 결정합니다. 수원(관개물, 유출 등)의 캡시 포자는 병원체 의 포자(zoospores)를 포착하는 핸드 펌프 기반 필터 용지(8-10 μm) 방법을 개발했으며, 나중에 는 새로운 루프 매개 액티어를 통해 병원체의 DNA를 증폭시키는 데 사용됩니다. P. capsici. 이 방법은 기존 PCR보다 40배 더 민감한 1.2 x 102 동물원/mL농도로부터 DNA를 증폭하고 검출할 수 있다. 밀접하게 관련된 종을 테스트 할 때 교차 증폭을 얻을 수 없습니다. LAMP는 또한 착색 램프 마스터 믹스 염료를 사용하여 수행되었으며, 현장의 빠른 감지를 위해 육안으로 읽을 수 있는 결과를 표시했습니다. 이 프로토콜은 오염된 관개 시스템을 통해 거주하거나 축적되거나 분산되는 다른 병원균에 적응할 수 있습니다.
Introduction
물 비용의 증가와 물 사용 의 환경 문제로 인해 농장과 보육원의 재활용 물이 점점 더 인기를 끌고 있습니다. 식물 질환의 확산과 발생을 줄이기 위해 재배자를 위해 많은 관개 방법이 개발되었습니다. 물의 근원(관개 또는 강수량)에 관계없이 유출이 발생하고, 많은 채소와 보육 재배자가유출1을수집하고 재활용할 수 있는 연못이 있다. 이는 재활용물이 작물2,3,34를관개하는 데 사용될 때 병원균의 확산을 선호하는 병원균 축적 가능성을 위한저수지를만든다. Oomycete 식물 병원체는 특히 동물원포어가 물에 축적되고 1 차 분산 포자는 자기 motile하지만 표면 물5,,6,,7이필요하기 때문에이 관행에서 특히 이점을 누릴 수 있습니다. Phytophthora capsici는 다른 방법으로 solanaceous cucurbit 작물의 상당수에 영향을 미치는 oomycete 병원체8. 종종 증상은 모종, 뿌리 및 크라운 부패의 감쇠입니다. 그러나 오이, 스쿼시, 멜론, 호박, 수박, 가지 및 후추와 같은 작물에서는 과일 부패9로인해 전체 수확량이 손실될 수 있습니다. 이 식물 병원균을 검출하는 알려진 방법이 있지만, 대부분은 이미 어떤 예방 살균제에 대한 너무 늦은 일이 발생 감염을 필요로10.
표적 미생물의 검출 및 진단을 위해 관개수를 테스트하는 전통적인 방법은 속도와 감도가 성공과 수익성 있는 작물생산(11,,12)에결정적인 시기에 구식 접근법이다. 표적 병원체(예를 들어, P. capsici용가지)에 취약한 식물 조직은 감염을 제거하고 검사하기 전에 장시간 관개 연못에 매달린 수정된 트랩에 부착된다. 식물 조직으로부터의 샘플은 반선택적 미디어(PARPH)에 도금되고 배양 성장을 위해 배양한 다음, 복합현미경(13)을이용하여 형태학적 식별이 수행된다. 선택적 매체를 이용하여 소량의 오염된 물을 소량도금하여14,,15를하위 배양하기 전에 다른 식물 병원균에 대한 다른 유사한 검출 방법이 있다. 이러한 방법은 유기체를 분리하기 위해 2 주에서 6 주, 여러 차례의 하위 배양이 필요하며, 각 종의 주요 형태학적 문자를 인식할 수 있도록 Phytophthora 진단에 대한 경험이 필요합니다. 이러한 전통적인 방법은 수원에 존재하는 다른 미생물에 의한 간섭과 같은 요인으로 인해 P. capsici에 의해 오염된 관개 수를 검출하는 데 잘 작동하지 않습니다. 파이티움 스프와 수인성 박테리아와 같은 일부 빠르게 성장하는 미생물은 접시에 과도하게 자랄 수 있어 P. capsici를 탐지할 수 없는16,,17.
이 연구의 목적은 관개 물에서 P. capsici 동물원포자를 검출하기 위해 현장 및 실험실 설정 모두에서 사용할 수있는 민감하고 구체적인 분자 방법을 개발하는 것이었습니다. 이 프로토콜은 P. capsici,18,19의1121베이스 쌍(bp) 단편을 기반으로 P. capsici를구체적으로 증폭시킬 수 있는 새로운 루프 매개 이스테어 증폭(LAMP) 프라이머 세트의 개발을 포함한다. 동외에서 이전에 개발된 LAMP 프라이머(2015)는 이 연구를 위해 개발된분석서(20)에비해 사용되었다.
LAMP 분석체는 종래의 중합효소 연쇄반응(PCR)(21)보다더 빠르고 민감하며 특이적임을 입증된 비교적 새로운 형태의 분자 검출이다. 일반적으로, 기존의 PCR 어설션은 500부(1.25 pg/μL) 미만을 감지할 수 없다. 대조적으로, 이전 연구는 LAMP의 감도가 종래의 PCR보다 10 ~ 1,000 배 높을 수 있으며 게놈 DNA22,,23의1 fg /μL조차도 쉽게 감지 할 수 있음을 보여주었습니다. 또한, 분석체는 증폭을 위한 휴대용 가열 블록을 사용하여 현장에서(종종 30분) 및 현장(현장에서) 신속하게 수행될 수 있으며, 양성 시료에 대한 색을 변화시키는 색염염(전기포혈의 필요성 제거). 이 연구에서는 필터 추출 방법을 사용하여 PCR 및 LAMP 분석의 감도를 비교했습니다. 제안된 검출 방법을 통해 연구자와 확장 에이전트는 2시간 이내에 다른 수원에서 P. capsici 포자의 존재를 쉽게 감지할 수 있습니다. 분석은 종래의 PCR보다 더 민감하다는 것이 입증되었으며 재배자가 사용하는 관개물에서 병원균의 존재를 검출함으로써 시상에서 검증되었다. 이 검출 방법은 재배자가 관개에 사용되는 다양한 수원에서 병원균의 존재와 인구 밀도를 추정할 수 있게 하여 파괴적인 발병과 경제적 손실을 방지할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
식물병원균에 대한 관개물의 시험은 관개 연못과 재활용 된 물(27)을사용하는 재배자에게 중요한 단계입니다. 관개 연못은 과잉 관개물이16,,27로존재했을 수 있는 병원균을 운반하는 연못으로 전달되기 때문에 다수의 식물병원균에 대한 저수지 및 번식지를 제공한다. 큰 수원에서 식물 병원균의 검출을 위한 전통적인 방법은 연못에 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 야채 프로젝트 ID # FP000016659에 대한 조지아 상품위원회의 재정 지원을 받았다. 저자는 피토프토라 spp의순수한 문화를 제공하는 조지아 대학 핑성 지 박사와 박사 앤 도랜스, 오하이오 주립 대학 감사합니다. 우리는 또한 연구 기간 내내 그들의 기술 지원에 대한 리 왕과 델로리스 베니에게 감사드립니다.
Materials
| Agarose gel powder | Thomas Scientific | C997J85 | |
| Buchner funnel | Southern Labware | JBF003 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620509 | |
| Chloroform | Fischer Scientific | C298-500 | |
| CTAB solution | Biosciences | 786-565 | |
| Dneasy Extraction Kit | Qiagen | 69104 | |
| Filter Flask | United | FHFL1000 | |
| Filter Paper | United Scientific Supplies | FPR009 | |
| Gel Green 10000X | Thomas Scientific | B003B68 (1/EA) | |
| Genie III | OptiGene | ||
| Hand pump | Thomas Scientific | 1163B06 | |
| Iso-amyl Alcohol | Fischer Scientific | BP1150-500 | |
| LAVA LAMP master mix | Lucigen | 30086-1 | |
| Magnetic bead DNA extraction | Genesig | genesigEASY-EK | |
| Magnetic Separator | Genesig | genesigEASY-MR | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma Aldrich | PVP40-500G | |
| Primers | Sigma Aldrich | ||
| Prism Mini Centrifuge | Labnet | C1801 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| UV Gel Doc | Analytik Jena | 849-00502-2 | |
| Warmstart Colorimetric Dye | Lucigen | E1800m | |
| Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704489EDU | |
| 70% isopropanol | Fischer Scientific | A451-1 |
References
- Hong, C., Moorman, G. J. Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities. Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).
- Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. Physiology, Genetics, Morphology, & Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater. Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).
- Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system. Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).
- Ghimire, S. R., et al. Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months. Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).
- Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges. Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).
- Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water. Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).
- Thomson, S., Allen, R. Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water. Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici. Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Sanogo, S., Ji, P. Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops. Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).
- Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water. Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).
- Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR. Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).
- Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. A review of advanced techniques for detecting plant diseases. Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).
- Wang, Z., et al. Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).
- Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan). Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).
- Pringsh, P. Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants. Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).
- Stewart-Wade, S. M. Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management. Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).
- Aragaki, M., Uchida, J. Y. Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov. Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).
- Tomlinson, J., Boonham, N. Potential of LAMP for detection of plant pathogens. CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).
- Li, P., et al. A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici. Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).
- Dong, Z., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici. Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).
- Khan, M., et al. Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani. Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).
- Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods. Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).
- Waliullah, S., et al. Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry. PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).
- Böhm, J., et al. Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).
- Klimczak, L., Prell, H. J. C. Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans. Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).
- Ghimire, S. R., et al. Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter. Phytopathology. 96 (6), (2006).
- Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields. Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).
- Aglietti, C., et al. Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection. AMB Express. 9 (1), 50 (2019).
- Almasi, M. A. Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).
- Gill, D. J. Pathogenic Pythium from irrigation ponds. Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).
