ループ媒介等熱増幅を用いた灌漑水中フィ トフトーラカプシ の検出

水の使用量の増加や水の使用に伴う環境問題により、農場や保育園の水のリサイクルがますます普及しています。植物病の広がりや発生を減らすために、生産者のために多くの灌漑方法が開発されています。水源(灌漑や降水量)に関係なく、流出が発生し、多くの野菜や保育園の生産者は、流出を収集し、リサイクルする池を持っています¹.これは、再生水が作物^2、3、43を灌漑するために使用される場合、病原体の広がりを支持²する可能性のある病原体蓄積のための貯水池^を4作成します。動物園の胞子は水に蓄積し、一次分散胞子は自己運動性であるが、表面水^55、6、76を必要とするので^、Oomycete7植物病原体は、この練習の恩恵を特に受ける。フィトフトラカプシチは、異なる方法で、ナス類とキュビリット作物のかなりの数に影響を与えるオマイセテ病原体⁸.多くの場合、症状は苗、根とクラウンの腐敗の減衰です。しかし、キュウリ、スカッシュ、メロン、カボチャ、スイカ、ナス、コショウなどの作物では、果^実腐敗9のために収穫全体が失われる可能性があります。この植物病原体を検出する方法は知られているが、ほとんどの感染は、任意の予防殺菌剤が有意な効果を有するには遅すぎる既に起こるために行われている¹⁰を必要とします。

標的微生物の検出と診断のための灌漑水をテストする従来の方法は、速度と感度が成功し、収益性の高い作物生産^11、12,12に不可欠である時代遅れのアプローチです。標的病原体(例えば、P.カプシチのナス)に感染のために除去され、検査される前に長期間、灌漑池に吊り下げられる変性トラップに付着している植物組織(例えば、P.カプシチのナス)に付着している。次いで植物組織からのサンプルを半選択的培地(PARPH)上でめっきし、培養増殖のためにインキュベートし、次いで、複合顕微鏡¹³を用いて形態学的同定が行われる。他の植物病原体に対しても、選択的培地を用いて、少量の汚染水をめっきしてから^、14,15,15をサブ培養する前に同様の検出方法がある。これらの方法は、2〜6週間の任意の場所、生物を分離するためのサブ培養のいくつかのラウンド、および各種の主要な形態学的文字を認識することができるようにフィトフトーラ診断上の経験を必要とする。これらの伝統的な方法は、水源にも存在する他の微生物による干渉などの要因により、P.カプシチによって汚染された灌漑水の検出にはうまく機能しません。ピシウム属細菌や水媒介細菌のような急速に成長している微生物は、P.カプシチを検出不能^16、17,17にするプレート上で増殖する可能性があります。

本研究の目的は、灌漑水中のP.カプシチ動物園を検出するために、現場と実験室の両方の設定で使用できる敏感で特異的な分子法を開発することであった。このプロトコルは、P.カプシチの1121基対(bp)フラグメントに基づいて、P.カプシチを特異的に増幅することができる新規ループ媒介等温増幅(LAMP)プライマーセットの開発^を含む、 P. capsici^19.19Dong et al. (2015) から以前に開発された LAMP プライマーは、この研究のために開発されたアッセイと比較して使用されました²⁰.

LAMPアッセイは、従来のポリメラーゼ連鎖反応^(PCR)21よりも迅速、感受性、および特異的であることが実証された比較的新しい分子検出形態である。一般に、従来のPCRアッセイでは500コピー(1.25 pg/μL)以下では検出できません。対照的に、以前の研究では、LAMPの感度は従来のPCRよりも10〜1,000倍高く、ゲノム^DNA22,23,23の1fg/μLでも容易に検出できることが示されている。さらに、アッセイは、増幅のためのポータブル加熱ブロックと正のサンプルの色を変化させる着色色素(電気泳動の必要性を取り除く)を使用して、迅速に(多くの場合、30分)およびオンサイト(フィールド)を行うことができます。本研究では、フィルター抽出法を用いてPCRとLAMPアッセイの感度を比較した。提案された検出方法により、研究者および拡張剤は、異なる水源からのP.カプシシ胞子の存在を2時間以内に容易に検出することができる。このアッセイは、従来のPCRよりも感度が高く、栽培者が使用する灌漑水中の病原体の存在を検出することによってその時点で検証されました。この検出方法により、生産者は灌漑に使用されている様々な水源における病原体の存在と人口密度を推定し、壊滅的な発生や経済的損失を防ぐことができます。