Summary

一次ニューロンにおけるタンパク質とシナプスマーカーの共局在化を研究する超分解能イメージング

Published: October 31, 2020
doi:

Summary

このプロトコルは、一次神経細胞培養におけるタンパク質の共局在化を研究するために超解像顕微鏡を採用する方法を示す。

Abstract

シナプスはニューロンの機能要素であり、その欠陥または損失はいくつかの神経変性疾患および神経疾患の基礎にある。画像化研究は、生理学的および病理学的状態におけるその機能および可塑性を調べるのに広く使用されている。タンパク質のサイズと構造のため、タンパク質のローカリゼーション研究には高解像度イメージング技術が必要です。本プロトコルでは、構造化された照明顕微鏡(SIM)を用いて、シナプスマーカーを用いた標的タンパク質のシナプスマーカーとの共局在化を一次ニューロンで研究する手順を説明する。SIMは、広視野顕微鏡の空間分解能を2倍にするパターン光照明技術で、約100nmのディテールに達します。このプロトコルは、堅牢な共局化研究に必要な制御と設定、およびイメージングデータを適切に分析するための統計的手法の概要を示します。

Introduction

シナプスの理解と見解は、フォスターとシェリントンによる1897年の最初の記述以来、大きく変わりましたそれ以来、神経伝達の知識とその背後にある分子プロセスは指数関数的に成長しました 2.シナプスは、2コンパートメントシステムとして考えることができることが明らかになりました:神経伝達物質の放出のための小胞を含むシナプス前コンパートメントと受容体3を有するシナプス後コンパートメント。この単純な見解は、過去20年間で、トランスミッタ結合をシグナル4に変換するために必要なタンパク質の複雑なネットワークに進化した。

理解の利益は、シナプスの次元に合わせて従来の光顕微鏡の回折限界を克服した超解像技術による部分565、6、7、8、9、10。,7,8,9,10,回折限界のため、光学顕微鏡は横11,12,12を超える解像度に達することができない。この限界を回避するために、異なるアプローチを使用して、異なる回折限界解像度に達する超解像技術が作成されました:SIM、STED(刺激放出枯渇顕微鏡)、PALM(光活性化局在化顕微鏡)およびSTORM(確率的光学再構成顕微鏡)13、14。13,SIMは、励起ビーム経路15に回折格子を挿入することにより、レーザーベースの広視野顕微鏡システムの空間分解能を倍増する。可動格子は、レーザービームを回折して、既知の照明パターン(通常はストライプ)を作成します。この意図的に構成された光パターンは、蛍光色素(試料の)の未知の空間分布に重ね合わされる。2つのパターンによって形成された干渉縞は、通常の広視野顕微鏡法で区別できない細かい細部を符号化する。最終的な超解決画像は、回折格子の移動と回転によって得られた同じサンプルのいくつかの生画像を数学的方法で組み合わせてデコードすることによって得られます。超解決画像の解像度は、側面で100nm、横方向の軸方向で500nm、横方向では150nm、3D-SIM16の軸方向では250nmに達する。16

シナプスの新しい理解は、シナプス機能障害が発症と進行に大きな役割を果たす多くの神経疾患の観点からさらに重要である17,,18.アルツハイマー病は、ダウン症、パーキンソン病、プリオン病、てんかん、自閉症スペクトラム障害および脆弱X症候群の中でもシナプス組成物、形態および機能19、20、21、22,の異常に関連している19,21,22

最近では、一連のSUMO特異的抗体を用いて、SIMを用いて、SYNOタンパク質の一次海馬ニューロンにおけるシナプトフィシン前および事後マーカーシナプトフィシンおよびPSD95を超分解能レベル23で共局在化させた。これにより、ニューロンにおけるSUMOの局在化の生化学的および共焦点的な顕微鏡の証拠を確認することができました。

ここでは、マウス海馬の一次ニューロンにおけるタンパク質の局在を研究するプロトコルについて述べている。同時に、このプロトコルは、異なるタイプの主要な神経細胞培養に適応され得る。

Protocol

1. 主要文化 #1.5(0.17 mm)のカバースリップ厚さの客観的要件に一致するチャンバーカバーリップ(イビディμスライド8ウェルまたはNunc Lab-Tekチャンバードカバーグラスなど)における培養マウス海馬主要ニューロン。 ポリL-リジン(100 μg/mL)の100 μLのカバースリップをコーティング。 翌日、チャンバー付きのカバーリップを滅菌リン酸緩衝生理食塩分(PBS)で2回洗います。 …

Representative Results

ここでは、神経タンパク質の共局在化を研究するための標準的なワークフローを紹介します。まず顕微鏡を校正し、次にサンプルのSIM分析を行いました。システムの較正のために、直径0.1μmの蛍光微小球を用いた。ビーズの超解決 3D-SIM 画像を取得すると、基になる画像データはフーリエ変換されて空間周波数表現に変換されます。 図2Aでは、明確な花のパターンは、?…

Discussion

シナプスの構造と組成を解明することは、記憶と認知を調節する生理学的および病理学的プロセスを理解するために重要である。正常な状態にある間、シナプスは記憶の構成要素であり、アルツハイマー病32のような複雑な神経疾患の根源でもある。ここで説明するプロトコルは、SIMと呼ばれる超解像顕微鏡技術を用いて神経タンパク質の共局在化を研究するのに役立つ。?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、原稿の建設的な批判のためにエドアルド・ミオッティに感謝したいと思います。この研究は、ブライトフォーカスA2019296F、フォンド・ディ・ベネフィチェンツァ – グルッポ・インテッサ・サンパオロ(LC)、フォンダツィオーネ・リージョネージュ・パー・ラ・リセルカ・バイオメディカ(Care4NeuroRare CP_20/2018)(CN)、マリー・スウォドフスカ・キュリー・イノベーティブ・トレーニング・ネットワーク(JK)によって支援されました。

Materials

0.4% Trypan blue solution  Thermo Fisher Scientific 15250061 Chemical
70 µm filter  Corning 352350 Equiment
Alexa Thermo Fisher Scientific Antibody
Antibody SENP1 Santa Cruz sc-271360 Antibody
B27 Supplement Life Technologies 17504044 Chemical
Bovine serum albumin  Merck 5470 Chemical
CaCl2 Merck Life Science 21115 Chemical
Chambered coverslips Ibidi 80826 Equiment
DyLight Thermo Fisher Scientific Antibody
FBS (Hyclone) GIBCO SH3007002 (CHA1111L) Serum
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent Thermo Fisher Scientific F8803 Equiment
Glucose Merck Life Science G8769 Chemical
Glutamax GIBCO 35050061 Chemical
HEPES Merck Life Science H3537 Chemical
L-Cystein  Merck Life Science  C6852-25g Chemical
MAP2 Merck AB15452 Antibody
MEM  Life Technologies 21575022 Medium
MgCl Merck Life Science M8266 Chemical
NaOH VWR International 1,091,371,000 Chemical
Neurobasal A Life Technologies 10888022 Medium
N-SIM Super Resolution Microscope Nikon Instrument
Papain Merck Life Science  P-3125 Chemical
paraformaldehyde  Thermo Fisher Scientific 28908 Chemical
Pen/Strep 10x Life Technologies 15140122 Chemical
phosphate-buffered saline  Gibco 10010023 Chemical
Poly-L lysine Sigma P2636 Chemical
ProLong Diamond Glass Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36970 Chemical
PSD95  NeuroMab K28/43 Antibody
Round coverglass Thermo 12052712 Equiment
SUMO1 Abcam ab32058 Antibody
Synaptophysin  Merck S5768  Antibody
Triton X-100  Merck T8787 Chemical
Trypsin inhibitor  Merck Life Science  T9003-500MG Chemical

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Russo, L., Natale, C., Conz, A., Kelk, J., Restelli, E., Chiesa, R., Salmona, M., Fioriti, L., Colnaghi, L. Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons. J. Vis. Exp. (164), e61434, doi:10.3791/61434 (2020).

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