Imaging super-risoluzione per studiare la co-localizzazione di proteine e marcatori sinaptici nei neuroni primari

La comprensione e la visione della sinapsi è cambiata enormemente dalla sua prima descrizione da Foster e Sherrington nel 1897¹. Da allora, la nostra conoscenza della comunicazione neuronale e dei processi molecolari alla base è cresciuta esponenzialmente². È diventato chiaro che le sinapsi possono essere pensate come un sistema a due compartimenti: un compartimento pre-sinaptico contenente vesciche per il rilascio di neurotrasmettitori e un compartimento post-sinaptico con recettori³. Questa visione semplicistica, negli ultimi vent’anni, si è evoluta in una complessa rete di proteine necessarie per trasdurre il legame trasmettitore nella segnalazione⁴.

I vantaggi nella comprensione sono in parte dovuti a tecniche di super-risoluzione che hanno superato il limite di diffrazione della microscopia leggera convenzionale per soddisfare la dimensione delle sinapsi^{meglio 5,6,7,8,9,10}. A causa del limite di diffrazione, un microscopio ottico non può raggiungere una risoluzione superiore a 200 nm^{lateralmente11},¹². Per aggirare questo limite, sono state create tecniche di super-risoluzione, utilizzando approcci diversi e raggiungendo diverse risoluzioni limite di sub-diffrazione: SIM, STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) e STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)^13,14. SIM raddoppia la risoluzione spaziale dei sistemi di microscopia a campo largo basati su laser inserendo una griglia di diffrazione nel percorso del fascio di eccitazione¹⁵. La grata mobile diffracts i raggi laser per creare un modello di illuminazione noto, di solito strisce. Questo modello di luce appositamente strutturato è sovrapposto alla distribuzione spaziale sconosciuta del colorante fluorescente (del campione). Le frange di interferenza formate dai due modelli codificano per dettagli fini altrimenti indistinguibili con la normale microscopia a campo largo. L’immagine finale super-risolta si ottiene combinando e decodificando con metodi matematici diverse immagini grezze dello stesso campione ottenute dalle traduzioni e rotazioni della grata di diffrazione. La risoluzione delle immagini super-risolte raggiunge i 100 nm nei 500 nm nelle direzioni assiali per 2D-SIM¹⁵ o 100 nm nei lateral e 250 nm nelle direzioni assiali per 3D-SIM¹⁶.

La nuova comprensione della sinapsi è ancora più importante alla luce dei molti disturbi neurologici in cui la disfunzione sinaptica svolge un ruolo importante nell’insorgenza e nella progressione^17,18. Morbo di Alzheimer, Sindrome di Down, Morbo di Parkinson, malattie prioni, epilessia, disturbi dello spettro autistico e sindrome X fragile tra gli altri sono stati collegati ad anomalie nella composizione sinaptica, morfologia e funzione^19,20,21,22.

Recentemente, utilizzando una serie di anticorpi specifici suMO, abbiamo usato la SIM per mostrare la co-localizzazione nei neuroni ippocampali primari delle proteine SUMO con i marcatori pre e post-sinaptici synaptophysin e PSD95 al livello di^{super-risoluzione 23}. Questo ci ha permesso di confermare la prova di microscopia biochimica e confocale della localizzazione SUMO nei neuroni.

Qui, descriviamo un protocollo per studiare la localizzazione delle proteine nei neuroni primari dell’ippocampo dei topi. Allo stesso tempo, questo protocollo può essere adattato a diversi tipi di colture neuronali primarie.