Summary

Imagerie super-résolution pour étudier la co-localisation des protéines et des marqueurs synaptiques dans les neurones primaires

Published: October 31, 2020
doi:

Summary

Ce protocole montre comment utiliser la microscopie à super résolution pour étudier la co-localisation des protéines dans les cultures neuronales primaires.

Abstract

Les synapses sont les éléments fonctionnels des neurones et leurs défauts ou pertes sont à la base de plusieurs troubles neurodégénératifs et neurologiques. Les études d’imagerie sont largement utilisées pour étudier leur fonction et leur plasticité dans des conditions physiologiques et pathologiques. En raison de leur taille et de leur structure, les études de localisation des protéines nécessitent des techniques d’imagerie à haute résolution. Dans ce protocole, nous décrivons une procédure d’étude dans les neurones primaires la co-localisation des protéines cibles avec des marqueurs synaptiques à un niveau de super-résolution utilisant la microscopie d’illumination structurée (SIM). SIM est une technique d’éclairage à motifs qui double la résolution spatiale de la microscopie à large champ, atteignant un détail d’environ 100 nm. Le protocole indique les contrôles et les paramètres requis pour des études de co-localisation robustes et une vue d’ensemble des méthodes statistiques pour analyser correctement les données d’imagerie.

Introduction

La compréhension et la vue de la synapse a énormément changé depuis sa première description par Foster et Sherrington en 18971. Depuis lors, notre connaissance de la communication neuronale et les processus moléculaires derrière elle a augmenté de façon exponentielle2. Il est devenu clair que les synapses peuvent être considérées comme un système à deux compartiments : un compartiment pré-synaptique contenant des vésicules pour la libération de neurotransmetteurs et un compartiment post-synaptique avec des récepteurs3. Cette vision simpliste, au cours des vingt dernières années, s’est transformée en un réseau complexe de protéines nécessaires pour transduire la liaison des émetteurs en signalisation4.

Les gains dans la compréhension sont en partie dus aux techniques de super-résolution qui ont surmonté la limite de diffraction de la microscopie légère conventionnelle pour convenir à la dimension des synapses mieux5,6,7,8,9,10. En raison de la limite de diffraction, un microscope optique ne peut pas atteindre une résolution supérieure à 200 nm par la suite11,12. Pour contourner cette limite, des techniques de superrésolution ont été créées, en utilisant différentes approches et en atteignant différentes résolutions limites de sous-diffraction : SIM, STED (Stimated Emission Ecution Exceed Microscopy), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) et STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)13,14. SIM double la résolution spatiale des systèmes de microscopie à large champ à base de laser en insérant une grille de diffraction dans le chemin de faisceaud’excitation 15. La grille mobile diffracts les faisceaux laser pour créer un modèle d’éclairage connu, généralement rayures. Ce motif de lumière volontairement structuré est superposé à la distribution spatiale inconnue du colorant fluorescent (de l’échantillon). Les franges d’interférence formées par les deux modèles codent pour des détails fins autrement indiscernables avec la microscopie normale de large champ. L’image finale super-résolue est obtenue en combinant et décodage avec des méthodes mathématiques plusieurs images brutes du même échantillon obtenus par les traductions et les rotations de la grille de diffraction. La résolution des images super-résolues atteint 100 nm dans le côté et 500 nm dans les directions axiales pour 2D-SIM15 ou 100 nm dans le latéral et 250 nm dans les directions axiales pour 3D-SIM16.

La nouvelle compréhension de la synapse est encore plus importante à la lumière des nombreux troubles neurologiques où le dysfonctionnement synaptique joue un rôle majeur dans l’apparition et la progression17,18. La maladie d’Alzheimer, le syndrome de Down, la maladie de Parkinson, les maladies à prions, l’épilepsie, les troubles du spectre autistique et le syndrome fragile de X, entre autres, ont été liés à des anomalies dans la composition synaptique, la morphologie et la fonction19,20,21,22.

Récemment, à l’aide d’un ensemble d’anticorps spécifiques à sumo, nous avons utilisé sim pour montrer la co-localisation dans les neurones hippocampaux primaires des protéines SUMO avec les marqueurs pré- et post-synaptiques synaptophysine et PSD95 au niveau de super-résolution23. Cela nous a permis de confirmer les preuves biochimiques et confocales de microscopie de la localisation sumo dans les neurones.

Ici, nous décrivons un protocole pour étudier la localisation des protéines dans les neurones primaires hippocampaux de souris. En même temps, ce protocole peut être adapté à différents types de cultures neuronales primaires.

Protocol

1. Cultures primaires Les neurones primaires hippocampaux de souris de culture dans les couvertures chambrées (telles que Ibidi μ-Slide 8 Well ou Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) qui correspondent à l’exigence objective pour #1,5 (0,17 mm) couvrent l’épaisseur. Pelage de couvercles en chambre avec 100 μL de poly-L-lysine (100 μg/mL). Le lendemain, lavez deux fois les couvercles chambrelés à l’une de la solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS). Pour obt…

Representative Results

Nous présentons ici le flux de travail standard pour étudier la co-localisation des protéines neuronales. Nous avons d’abord calibré le microscope et ensuite nous avons effectué l’analyse SIM des échantillons. Pour calibrer le système, nous avons utilisé des microsphères fluorescentes de 0,1 μm de diamètre. Lors de l’obtention d’images 3D-SIM super-résolues des perles, les données d’image sous-jacentes sont fourier-transformés pour les re-convertir en une représentation de fréquence spatiale. Da…

Discussion

L’élucidation de la structure et de la composition de la synapse est cruciale pour comprendre les processus physiologiques et pathologiques qui régulent la mémoire et la cognition. Alors que dans l’état normal, les synapses sont les éléments constitutifs de la mémoire, ils sont également à la base de troubles neurologiques complexes tels que la maladie d’Alzheimer32. Le protocole décrit ici sert à étudier la co-localisation des protéines neuronales avec une technique de microsco…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier Edoardo Micotti pour la critique constructive du manuscrit. Cette étude a été soutenue par BrightFocus A2019296F, par Fondo di Beneficenza – Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), par Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) et par le Sk’odowska-Curie Innovative Training Network (JK).

Materials

0.4% Trypan blue solution  Thermo Fisher Scientific 15250061 Chemical
70 µm filter  Corning 352350 Equiment
Alexa Thermo Fisher Scientific Antibody
Antibody SENP1 Santa Cruz sc-271360 Antibody
B27 Supplement Life Technologies 17504044 Chemical
Bovine serum albumin  Merck 5470 Chemical
CaCl2 Merck Life Science 21115 Chemical
Chambered coverslips Ibidi 80826 Equiment
DyLight Thermo Fisher Scientific Antibody
FBS (Hyclone) GIBCO SH3007002 (CHA1111L) Serum
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent Thermo Fisher Scientific F8803 Equiment
Glucose Merck Life Science G8769 Chemical
Glutamax GIBCO 35050061 Chemical
HEPES Merck Life Science H3537 Chemical
L-Cystein  Merck Life Science  C6852-25g Chemical
MAP2 Merck AB15452 Antibody
MEM  Life Technologies 21575022 Medium
MgCl Merck Life Science M8266 Chemical
NaOH VWR International 1,091,371,000 Chemical
Neurobasal A Life Technologies 10888022 Medium
N-SIM Super Resolution Microscope Nikon Instrument
Papain Merck Life Science  P-3125 Chemical
paraformaldehyde  Thermo Fisher Scientific 28908 Chemical
Pen/Strep 10x Life Technologies 15140122 Chemical
phosphate-buffered saline  Gibco 10010023 Chemical
Poly-L lysine Sigma P2636 Chemical
ProLong Diamond Glass Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36970 Chemical
PSD95  NeuroMab K28/43 Antibody
Round coverglass Thermo 12052712 Equiment
SUMO1 Abcam ab32058 Antibody
Synaptophysin  Merck S5768  Antibody
Triton X-100  Merck T8787 Chemical
Trypsin inhibitor  Merck Life Science  T9003-500MG Chemical

References

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Russo, L., Natale, C., Conz, A., Kelk, J., Restelli, E., Chiesa, R., Salmona, M., Fioriti, L., Colnaghi, L. Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons. J. Vis. Exp. (164), e61434, doi:10.3791/61434 (2020).

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