التصوير فائق الدقة لدراسة التعريب المشترك للبروتينات وعلامات متشابك في الخلايا العصبية الأولية
Summary
هذا البروتوكول يوضح كيفية استخدام المجهر فائقة الدقة لدراسة البروتين التعريب المشترك في الثقافات العصبية الأولية.
Abstract
نقاط الاشتباك العصبي هي العناصر الوظيفية للخلايا العصبية وعيوبها أو خسائرها هي في أساس العديد من الاضطرابات العصبية والعصبية. وتستخدم على نطاق واسع دراسات التصوير للتحقيق في وظيفتها واللدونية في الظروف الفسيولوجية والمرضية. بسبب حجمها وهيكلها، تتطلب دراسات توطين البروتينات تقنيات تصوير عالية الدقة. في هذا البروتوكول، نحن وصف إجراء لدراسة في الخلايا العصبية الأولية التعريب المشترك للبروتينات المستهدفة مع علامات متشابك على مستوى فائقة الدقة باستخدام المجهر الإضاءة منظم (SIM). SIM هي تقنية إضاءة منقوشة تعمل على مضاعفة الدقة المكانية للمجهر الواسع، لتصل إلى تفاصيل تبلغ حوالي 100 نانومتر. يشير البروتوكول إلى عناصر التحكم والإعدادات المطلوبة لإجراء دراسات قوية للترجمة المشتركة ونظرة عامة على الأساليب الإحصائية لتحليل بيانات التصوير بشكل صحيح.
Introduction
وقد تغير فهم وعرض المشبك بشكل كبير منذ وصفه الأول من قبل فوستر وشيرينغتون في 18971. ومنذ ذلك الحين، معرفتنا الاتصالات العصبية والعمليات الجزيئية وراء ذلك نمت أضعافامضاعفة 2. أصبح من الواضح أنه يمكن التفكير في نقاط الاشتباك العصبي كنظام حجرتين: حجرة ما قبل متشابك تحتوي على حويصلات للافراج عن الناقلات العصبية وحجرة ما بعد متشابك مع مستقبلات3. وقد تطورت هذه النظرة التبسيطية، في السنوات العشرين الماضية، إلى شبكة معقدة من البروتينات المطلوبة لتحويل الإرسال إلى إشارة4.
المكاسب في فهم جزئيا بسبب تقنيات فائقة الدقة التي تغلبت على الحد الأقصى للحجم المجهري الضوئي التقليدي لتتناسب مع البعد من نقاط الاشتباك العصبي أفضل5،6،7،8،9،10. بسبب الحد من الانعراج ، لا يمكن للمجهر البصري أن يصل إلى قرار فوق 200 نانومتر11،12. لتجاوز هذا الحد، تم إنشاء تقنيات فائقة الدقة، وذلك باستخدام نهج مختلفة والوصول إلى مختلف القرارات الحد من الحيود الفرعي: SIM، STED (المجهر استنفاد الانبعاثات المحفزة)، النخيل (PhotoActivated التعريب المجهري) و STORM (المجهر إعادة الإعمار البصرية العشوائية)13،14. تُضاعف SIM الدقة المكانية لأنظمة المجهر واسعة النطاق القائمة على الليزر عن طريق إدخال صرّار حيود في مسار شعاع الإثارة15. diffracts صر المنقولة أشعة الليزر لخلق نمط الإضاءة المعروفة، وعادة المشارب. يتم فرض هذا النمط من الضوء المنظم عن قصد إلى التوزيع المكاني غير معروف للصبغة الفلورية (من العينة). هامش التداخل التي شكلتها نمطين ترميز لتفاصيل دقيقة لا يمكن تحديدها خلاف ذلك مع المجهر العادي واسعة المجال. يتم الحصول على الصورة النهائية الفائقة من خلال الجمع بين وفك مع الأساليب الرياضية عدة صور خام من نفس العينة التي تم الحصول عليها من خلال ترجمات وتناوب الصريف الحيود. قرار فائقة حل الصور تصل إلى 100 نانومتر في الجانبي و 500 نانومتر في الاتجاهات المحورية ل2D-SIM15 أو 100 نانومتر في الجانبي و 250 نانومتر في الاتجاهات المحورية ل3D-SIM16.
الفهم الجديد للمشابك هو أكثر أهمية في ضوء العديد من الاضطرابات العصبية حيث خلل متشابك يلعب دورا رئيسيا في بداية وتقدم17,18. مرض الزهايمر، متلازمة داون، مرض باركنسون، أمراض البريون، الصرع، اضطرابات طيف التوحد ومتلازمة X الهشة من بين أمور أخرى قد تم ربطها بتشوهات في التركيب متشابك، مورفولوجيا وظيفة19،20،21،22.
في الآونة الأخيرة، وذلك باستخدام مجموعة من الأجسام المضادة سومو محددة، استخدمنا سيم لإظهار التعريب المشترك في الخلايا العصبية فرس النهر الأولية من البروتينات سومو مع علامات ما قبل وما بعد متشابك سينابتوفيسين و PSD95 على مستوى فائقة الدقة23. هذا مكننا من تأكيد الأدلة المجهرية الحيوية والمجهرية الميكولوجية لتوطين سومو في الخلايا العصبية.
هنا، ونحن وصف بروتوكول لدراسة توطين البروتينات في الخلايا العصبية الأولية فرس النهر الماوس. في الوقت نفسه، قد يتم تكييف هذا البروتوكول مع أنواع مختلفة من الثقافات العصبية الأولية.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن توضيح بنية وتكوين المشبك أمر بالغ الأهمية لفهم العمليات الفسيولوجية والمرضية التي تنظم الذاكرة والإدراك. بينما في الحالة الطبيعية، نقاط الاشتباك العصبي هي لبنات بناء الذاكرة، كما أنها تكمن وراء الاضطرابات العصبية المعقدة مثل مرض الزهايمر32. البروتوكول الموصوف هنا يعمل ع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفان أن يشكرا إدواردو ميكوتي على انتقاده البناء للمخطوطة. وقد دعمت هذه الدراسة من قبل BrightFocus A2019296F، من قبل فوندو دي Beneficenza – Gruppo Intesa Sanpaolo (LC)، من قبل Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) ومن قبل شبكة التدريب المبتكرة ماري Skłodowska-Curie (JK).
Materials
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Chemical |
| 70 µm filter | Corning | 352350 | Equiment |
| Alexa | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
| Antibody SENP1 | Santa Cruz | sc-271360 | Antibody |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Chemical |
| Bovine serum albumin | Merck | 5470 | Chemical |
| CaCl2 | Merck Life Science | 21115 | Chemical |
| Chambered coverslips | Ibidi | 80826 | Equiment |
| DyLight | Thermo Fisher Scientific | – | Antibody |
| FBS (Hyclone) | GIBCO | SH3007002 (CHA1111L) | Serum |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent | Thermo Fisher Scientific | F8803 | Equiment |
| Glucose | Merck Life Science | G8769 | Chemical |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | Chemical |
| HEPES | Merck Life Science | H3537 | Chemical |
| L-Cystein | Merck Life Science | C6852-25g | Chemical |
| MAP2 | Merck | AB15452 | Antibody |
| MEM | Life Technologies | 21575022 | Medium |
| MgCl | Merck Life Science | M8266 | Chemical |
| NaOH | VWR International | 1,091,371,000 | Chemical |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888022 | Medium |
| N-SIM Super Resolution Microscope | Nikon | – | Instrument |
| Papain | Merck Life Science | P-3125 | Chemical |
| paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Chemical |
| Pen/Strep 10x | Life Technologies | 15140122 | Chemical |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Chemical |
| Poly-L lysine | Sigma | P2636 | Chemical |
| ProLong Diamond Glass Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Chemical |
| PSD95 | NeuroMab | K28/43 | Antibody |
| Round coverglass | Thermo | 12052712 | Equiment |
| SUMO1 | Abcam | ab32058 | Antibody |
| Synaptophysin | Merck | S5768 | Antibody |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | Chemical |
| Trypsin inhibitor | Merck Life Science | T9003-500MG | Chemical |
References
- Foster, M., Sherrington, C. S. . A textbook of physiology, part three: The central nervous system (7th ed.). , (1897).
- Choquet, D., Triller, A. The Dynamic Synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
- McAllister, A. K. Dynamic Aspects of CNS Synapse Formation. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 425-450 (2007).
- Yuzaki, M. Two Classes of Secreted Synaptic Organizers in the Central Nervous System. Annual Review of Physiology. 80 (1), 243-262 (2018).
- Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
- Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
- Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).
- Badawi, Y., Nishimune, H. Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses. Neuroscience Letters. 715, 134644 (2020).
- Scalisi, S., Barberis, A., Petrini, E. M., Zanacchi, F. C., Diaspro, A. Unveiling the Inhibitory Synapse Organization Using Superresolution Microscopy. Biophysical Journal. 116 (3), 133 (2019).
- Yang, X., Specht, C. G. Subsynaptic Domains in Super-Resolution Microscopy: The Treachery of Images. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, (2019).
- Monro, T. Beyond the diffraction limit. Nature Photonics. 3 (7), 361 (2009).
- Won, R. Eyes on super-resolution. Nature Photonics. 3 (7), 368-369 (2009).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6 (1), 27290 (2016).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Brose, N., O’Connor, V., Skehel, P. Synaptopathy: dysfunction of synaptic function. Biochemical Society Transactions. 38 (2), 443-444 (2010).
- Tyebji, S., Hannan, A. J. Synaptopathic mechanisms of neurodegeneration and dementia: Insights from Huntington’s disease. Progress in Neurobiology. 153, 18-45 (2017).
- Won, H., Mah, W., Kim, E. Autism spectrum disorder causes, mechanisms, and treatments: focus on neuronal synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, (2013).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. The State of Synapses in Fragile X Syndrome. The Neuroscientist. 15 (5), 549-567 (2009).
- Pavlowsky, A., Chelly, J., Billuart, P. Emerging major synaptic signaling pathways involved in intellectual disability. Molecular Psychiatry. 17 (7), 682-693 (2012).
- Senatore, A., Restelli, E., Chiesa, R. Synaptic dysfunction in prion diseases: a trafficking problem. International Journal of Cell Biology. 2013, 543803 (2013).
- Colnaghi, L., et al. Super Resolution Microscopy of SUMO Proteins in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Müller, M., Mönkemöller, V., Hennig, S., Hübner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7 (1), 10980 (2016).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy. Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).
- Schaefer, L. H., Schuster, D., Schaffer, J. Structured illumination microscopy: artefact analysis and reduction utilizing a parameter optimization approach. Journal of Microscopy. 216 (2), 165-174 (2004).
- Culley, S., et al. NanoJ-SQUIRREL: quantitative mapping and minimisation of super-resolution optical imaging artefacts. Nature Methods. 15 (4), 263-266 (2018).
- Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. Measurement of co-localization of objects in dual-colour confocal images. Journal of Microscopy. 169 (3), 375-382 (1993).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, 213-232 (2006).
- Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
- Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution Microscopy Approaches for Live Cell Imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Karras, C., et al. Successful optimization of reconstruction parameters in structured illumination microscopy – A practical guide. Optics Communications. 436, 69-75 (2019).
- Bereczki, E., et al. Synaptic markers of cognitive decline in neurodegenerative diseases: a proteomic approach. Brain: A Journal of Neurology. 141 (2), 582-595 (2018).
- Gilestro, G. F., Tononi, G., Cirelli, C. Widespread Changes in Synaptic Markers as a Function of Sleep and Wakefulness in Drosophila. Science. 324 (5923), 109-112 (2009).
- Adler, J., Parmryd, I. Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander’s overlap coefficient. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (8), 733-742 (2010).
