Переваривание целых глаз мыши для мульти-параметрического потока Цитометрического анализа моноядерных фагоцитов

Врожденная иммунная система включает в себя несколько типов клеток, которые стимулируют активацию дополнения и воспаление. Врожденные иммунные клетки включают естественные клетки убийцы (НК), тучные клетки, базофилы, эозинофилы, нейтрофилов и моноядерные фагоциты. Моноядерные фагоциты, которые состоят из моноцитов, макрофагов и дендритных клеток, были вовлечены в патофизиологию множественных офтальмологических состояний, включая увеит, диабетическую ретинопатию и возрастную макулярную дегенерацию (AMD)¹. В этом протоколе мы сосредоточимся на выявлении моноядерных фагоцитов с использованием многотеатрического цитометрического анализа потока в мышиной модели неоваскулярной AMD^2. Этот протокол адаптируется для мышиных моделей диабетической ретинопатии и/или увеита, но более обширное рассечение глаз рекомендуется из-за системного характера этих заболеваний.

Моноядерные фагоциты выражают перекрывающиеся маркеры поверхности клеток. Долгосрочные ткани резидентов макрофагов и микроглии происходят из желточного мешка полученных эритромиелоидных^{прародителя 3}, в то время как переработка макрофагов и дендритных клеток отличаются от костного мозга полученных макрофагов дендритных клеток^{прародителя 4}. Маркеры поверхности клеток мыши, общие для моноцитов, макрофагов и дендритных клеток включают CD45, CD11b⁵, F4/80⁶, Cx3cr1⁷, и внутриклеточный маркер Iba1⁸. Для того, чтобы преодолеть эту проблему, транскриптомный анализ макрофагов, моноцитов и дендритных клеток из нескольких тканей определяет CD64 как макрофаг-специфический маркер поверхности^{клеток 6}. Макрофаги были описаны в радужной оболочке глаза, хороид, цилиарного тела, и зрительного нерва в здоровых^{глазах 3}. Кроме того, дендритная идентификация клеток является более сложной; наиболее специфический метод дендритной идентификации клеток требует картирования судьбы с помощью мыши репортера^9. Независимо от этой линии репортера, выражение CD11c и MHCII в сочетании с отсутствием CD64 может определить потенциальные дендритные^{клетки 6,10}. Дендритные клетки были выявлены в роговицы, конъюнктивы, радужной оболочки глаза, и хороид в нормальных^{глазах 11}. Микроглии являются специализированными макрофагами, расположенными в сетчатке, защищенными гемово-сетчаткой барьером и полученными из клеток-предшественников желточного^{мешка 12.} В результате, микроглии сетчатки могут быть дифференцированы от моноцитов полученных макрофагов их тусклый уровень экспрессии CD45¹³ и высокие уровни Tmem119, который доступен в качестве потока цитометрии^{антитела 14}. После активации микроглии, однако, CD45 может быть до регулируемых¹⁵ и Tmem119 может быть вниз^{регулируется 3}, демонстрируя сложность биологии микроглии, и это, вероятно, имеет отношение как в AMD и его мыши модели. Наконец, моноциты можно разделить по крайней мере на два подтипа, включая классический и неклассический. Классические моноциты отображаютCCR2 и Ly6C высокой CX3CR1 низкой экспрессии, и неклассических моноцитов продемонстрировать CCR2^–Ly6C^низкийCX3CR1^{высокие маркеры 5}.

В связи с необходимостью количественного анализа экспрессии маркеров, т.е. высоких и низких/димовых уровней, цитометрия многотеатрийного потока является идеальным методом для дискриминации моноцитов, макрофагов, микроглий и дендритных клеток в глазу и других тканях. Дополнительные преимущества включают идентификацию суб популяций, возможность использования флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) для сортировки популяций клеток для транскриптомного или протеомного анализа, а также картирование судьбы. Основным недостатком цитометрии многотехатрийного потока является отсутствие архитектуры тканей. Это можно преодолеть путем офтальмологического вскрытия в различные глазные подкомпартии: роговицу, конъюнктиву, радужную оболочку, хрусталик, сетчатку и хороидно-склерический комплекс. Кроме того, может быть выполнена подтверждаемая иммунофлуоресценция, но ограниченная количеством маркеров и отсутствием надежной количественной оценки.

Геном широкий ассоциации исследования связаны несколько генов дополнения с AMD¹⁶. Активация дополнения приводит к выработке анафилактоксина, набору лейкоцитов и, как следствие, воспалению. В дополнение к рецептору недостаточно мышей, лазерная травма уменьшает моноядерных фагоцитов набора и лазерной индуцированных хороидной неоваскуляризации (CNV)^{области 17}. Аналогичным образом, C-C мотив хемокин рецептор 2 (CCR2) нокаут мыши, которая не хватает моноцитов набора в ткани, демонстрирует как снижение моноядерных фагоцитов набора и лазерной индуцированной области CNV¹⁸. Эти данные связывают дополнение и моноядерные фагоциты с экспериментальным CNV и, возможно, неоваскулярной AMD. В поддержку этой ассоциации, дополнение рецепторов дисрегулируются на периферических моноцитов крови у пациентов с неоваскулярной AMD^19,20. Эти данные свидетельствуют о сильной связи между AMD и моноядерными фагоцитами.

В этой рукописи мы будем использовать экспериментальную лазерную индуцированную модель CNV для характеристики моноядерных популяций фагоцитов в мышином глазу с использованием цитометрии многотактного потока. Лазерно-индуцированной CNV является стандартной моделью мыши неоваскулярной AMD, которая продемонстрировала эффективность текущей первой линии неоваскулярной терапии AMD²¹. Этот протокол будет описывать энуклеацию глаз мыши, рассечение глаз, пищеварение в одноклеточную подвеску, окрашивание антител, определение лазерных напряжений с использованием одного цветового контроля и стратегию фиксации с использованием флуоресценции минус один (FMO) управления. Для подробного описания лазерной индуцированной модели CNV, пожалуйста, смотрите предыдущую публикацию²². Используя этот протокол, мы определим микроглии, моноциты, дендритные клетки и популяции макрофагов. Кроме того, мы будем использовать MHCII и CD11c для дальнейшего определения подмножего макрофагов в лазерной индуцированной модели CNV.