Vertering van hele muisogen voor multiparameterstroomcytometrische analyse van mononucleaire fagocyten

Het aangeboren immuunsysteem omvat meerdere celtypen die complementactivatie en ontsteking stimuleren. Aangeboren immuuncellen omvatten natural killer (NK) cellen, mestcellen, basofielen, eosinofielen, neutrofielen en mononucleaire fagocyten. Mononucleaire fagocyten, die zijn samengesteld uit monocyten, macrofagen en dendritische cellen, zijn betrokken bij de pathofysiologie van meerdere oogheelkundige aandoeningen, waaronder uveïtis, diabetische retinopathie en leeftijdsgebonden maculadegeneratie (AMD)¹. In dit protocol zullen we ons richten op de identificatie van mononucleaire fagocyten met behulp van multi-parameter flow cytometrische analyse in een muismodel van neovasculaire AMD². Dit protocol is aanpasbaar voor muismodellen van diabetische retinopathie en/of uveïtis, maar uitgebreidere oculaire dissectie wordt aanbevolen vanwege de systemische aard van deze ziekten.

Mononucleaire fagocyten drukken overlappende celoppervlakmarkeringen uit. Ingezeten macrofagen en microglia van langdurig weefsel zijn afkomstig van de van de dooierzak afgeleide erytromyeloïde voorloper³, terwijl recycling van macrofagen en dendritische cellen zich onderscheidt van de van beenmerg afgeleide macrofaagdendritische celveredelvader⁴. Muisceloppervlakmarkeringen die gebruikelijk zijn voor monocyten, macrofagen en dendritische cellen omvatten CD45, CD11b⁵, F4/80⁶, Cx3cr1⁷en de intracellulaire marker Iba1⁸. Om deze uitdaging het hoofd te bieden, definieert transcriptomische analyse van macrofagen, monocyten en dendritische cellen uit meerdere weefsels CD64 als een macrofaagspecifieke celoppervlakmarker⁶. Macrofagen zijn beschreven in de iris, choroïde, ciliaire lichaam en oogzenuw in gezonde ogen³. Als alternatief is dendritische celidentificatie moeilijker; de meest specifieke methode voor dendritische celidentificatie vereist lottoewijzing met behulp van de Zbtb46-GFP-reportermuis⁹. Onafhankelijk van deze melderlijn kan de expressie van CD11c en MHCII in combinatie met de afwezigheid van CD64 potentiële dendritische cellen^6,10identificeren . Dendritische cellen zijn geïdentificeerd in hoornvlies, conjunctiva, iris en choroïd in normale ogen¹¹. Microglia zijn gespecialiseerde macrofagen in het netvlies, beschermd door de bloed-retinale barrière, en afgeleid van dooierzak voorloper cellen¹². Als gevolg hiervan kan retinale microglia worden onderscheiden van monocyten-afgeleide macrofagen door hun dimniveaus van CD45-expressie¹³ en hoge niveaus van Tmem119, die beschikbaar is als een flowcytometrie-antilichaam¹⁴. Bij microglia-activering kan CD45 echter up-regulated¹⁵ zijn en Tmem119 kan down-regulated³zijn , wat de complexiteit van microgliabiologie aantoont en dit is waarschijnlijk relevant in zowel AMD als het muismodel. Ten slotte kunnen monocyten worden onderverdeeld in ten minste twee subtypen, waaronder klassiek en niet-klassiek. Klassieke monocyten tonen CCR2⁺Ly6C^hogeCX3CR1^lage expressie, en niet-klassieke monocyten tonen CCR2^–Ly6C^lageCX3CR1^hoge markers⁵.

Vanwege de noodzaak van de kwantitatieve analyse van markerexpressie, d.w.z. hoge versus lage/dimniveaus, is multiparameterstroomcytometrie de ideale methode voor discriminatie tussen monocyten, macrofagen, microglia en dendritische cellen in het oog en andere weefsels. Extra voordelen zijn de identificatie van subpopulaties, de mogelijkheid om fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) te gebruiken om celpopulaties te sorteren voor transcriptomische of proteomische analyse, en lottoewijzing. Het grootste nadeel van multi-parameter flow cytometrie is het gebrek aan weefselarchitectuur. Dit kan worden overwonnen door de oogheelkundige dissectie in de verschillende oogsubcompartementen: hoornvlies, conjunctiva, iris, lens, netvlies en choroid-sclera-complex. Bovendien kan bevestigende immunofluorescentiebeeldvorming worden uitgevoerd, maar wordt deze beperkt door het aantal markers en het gebrek aan robuuste kwantificering.

Genoombrede associatiestudies hebben meerdere complementgenen gekoppeld aan AMD¹⁶. Complement activering leidt tot anafylaxie productie, leukocyten rekrutering, en resulterende ontsteking. Als aanvulling op receptordeficiënte muizen vermindert laserletsel mononucleaire fagocytenwerving en lasergeïnduceerde choroïdale neovascularisatie (CNV) gebied¹⁷. Evenzo toont het C-C-motief chemokine receptor 2 (CCR2) knock-outmuis, die een tekort heeft aan monocytenwerving aan het weefsel, zowel verminderde mononucleaire fagocytenwerving als lasergeïnduceerde CNV-gebied¹⁸. Deze gegevens koppelen complementaire en mononucleaire fagocyten aan experimentele CNV en mogelijk neovasculaire AMD. Ter ondersteuning van deze associatie worden complementreceptoren gedyreguleerd op perifere bloedmonocyten bij patiënten met neovasculaire AMD^19,20. Deze gegevens tonen een sterke associatie aan tussen AMD en mononucleaire fagocyten.

In dit manuscript zullen we het experimentele lasergeïnduceerde CNV-model gebruiken om de mononucleaire fagocytenpopulaties in het muisoog te karakteriseren met behulp van multiparameterstroomcytometrie. Lasergeïnduceerde CNV is het standaard muismodel van neovasculaire AMD, dat de werkzaamheid van de huidige eerstelijns neovasculaire AMD-therapie^{aantoonde 21}. Dit protocol beschrijft enucleatie van muisogen, oculaire dissectie, spijsvertering in een eencellige suspensie, antilichaamkleuring, bepaling van laserspanningen met behulp van enkele kleurregelaars en gatingstrategie met behulp van fluorescentie minus één (FMO) bedieningselementen. Voor een gedetailleerde beschrijving van het lasergeïnduceerde CNV-model, zie een eerdere publicatie²². Met behulp van dit protocol definiëren we microglia, monocyten, dendritische cellen en macrofaagpopulaties. Verder zullen we MHCII en CD11c gebruiken om macrofaagsubsets verder te definiëren binnen het lasergeïnduceerde CNV-model.