Digestão de olhos inteiros de rato para análise citométrica de fluxo multi-parameter de fagocitos mononucleares

O sistema imunológico inato inclui múltiplos tipos de células que estimulam a ativação e inflamação complementares. As células imunes inatas incluem células assassinas naturais (NK), células de mastro, basófilos, eosinófilos, neutrófilos e fagocitos mononucleares. Os fagocitos mononucleares, compostos por monócitos, macrófagos e células dendríticas, foram implicados na fisiopatologia de múltiplas condições oftálmicas, incluindo uveíte, retinopatia diabética e degeneração macular relacionada à idade (AMD)¹. Neste protocolo, focaremos na identificação de faócitos mononucleares utilizando análises citométricas de fluxo de vários parâmetros em um modelo de mouse de AMD neovascular². Este protocolo é adaptável para modelos de camundongos de retinopatia diabética e/ou uveíte, mas a dissecção ocular mais extensa é recomendada devido à natureza sistêmica dessas doenças.

Os fagocitos mononucleares expressam marcadores de superfície de células sobrepostos. Os macrófagos residentes de tecido de longa duração e a microglia são originários do progenitor de células eritrolóides derivados da gema^3,enquanto a reciclagem de macrófagos e células dendríticas se diferenciam do progenitor de células dendríticas derivados da medula óssea⁴. Os marcadores de superfície de células do rato comuns a monócitos, macrófagos e células dendríticas incluem CD45, CD11b⁵, F4/80^6,Cx3cr1⁷e o marcador intracelular Iba1⁸. Para superar esse desafio, a análise transcriômica de macrófagos, monócitos e células dendríticas de múltiplos tecidos define CD64 como um marcador de superfície celular específico para macrófago⁶. Macrófagos foram descritos na íris, corpo ciliar, ciliar e nervo óptico em olhos saudáveis³. Alternativamente, a identificação de células dendríticas é mais difícil; o método mais específico de identificação celular dendrítica requer mapeamento do destino usando o mouse repórter Zbtb46-GFP⁹. Independente desta linha de repórteres, a expressão de CD11c e MHCII em conjunto com a ausência de CD64 pode identificar potenciais células dendríticas^6,10. Células dendríticas foram identificadas em córnea, conjuntiva, íris e coroide em olhos normais¹¹. Microglia são macrófagos especializados localizados na retina, protegidos pela barreira hemrateira-retina, e derivados de células progenitoras do sac gema¹². Como resultado, a microglia da retina pode ser diferenciada dos macrófagos derivados de monócitos por seus níveis fracos de expressão CD45¹³ e altos níveis de Tmem119, que está disponível como anticorpo citometria de fluxo¹⁴. Após a ativação da microglia, no entanto, o CD45 pode ser regulado¹⁵ e O Tmem119 pode ser regulado³, demonstrando a complexidade da biologia da microglia e isso é provavelmente relevante tanto na AMD quanto em seu modelo de mouse. Finalmente, os monócitos podem ser divididos em pelo menos dois subtipos, incluindo clássico e não clássico. Monócitos clássicos exibem ccr2⁺Ly6C^altabaixa expressão CX3CR1, e monócitos não clássicos demonstram CCR2^–Ly6C^baixoCX3CR1^{marcadores altos 5}.

Devido à necessidade da análise quantitativa da expressão marcadora, ou seja, níveis altos versus baixos/fracos, a citometria de fluxo de vários parâmetros é o método ideal para a discriminação entre monócitos, macrófagos, microglia e células dendríticas no olho e outros tecidos. Outras vantagens incluem a identificação de sub populações, a capacidade de usar a triagem celular ativada por fluorescência (FACS) para classificar populações celulares para análise transcriômica ou proteômica e mapeamento do destino. A maior desvantagem da citometria de fluxo de vários parâmetros é a falta de arquitetura tecidual. Isso pode ser superado pela dissecção oftálmica nos diversos subcoentamentos oculares: córnea, conjuntiva, íris, lente, retina e complexo coroide-esclera. Além disso, a imagem confirmatória de imunofluorescência pode ser realizada, mas é limitada pelo número de marcadores e falta de quantitação robusta.

Estudos de associação de genomas associaram múltiplos genes complementares com a AMD¹⁶. A ativação complementar leva à produção de anafilatoxinas, recrutamento de leucócitos e inflamação resultante. Em camundongos deficientes receptores complementares, a lesão a laser reduz o recrutamento de fagocitos mononucleares e a área de neovascularização choroidal induzida por laser (CNV)¹⁷. Da mesma forma, o camundongo c-c 2 (CCR2), que é deficiente no recrutamento de monócitos para o tecido, demonstra tanto a diminuição do recrutamento de faócitos mononucleares quanto a área cnv induzida por laser¹⁸. Esses dados ligam complementos e fagocitos mononucleares com CNV experimental e possivelmente AMD neovascular. Em apoio a esta associação, os receptores complementares são desregulados em monócitos sanguíneos periféricos em pacientes com AMD neovascular^19,20. Esses dados demonstram forte associação entre os faócitos AMD e mononucleares.

Neste manuscrito, usaremos o modelo experimental de CNV induzido a laser para caracterizar as populações de fagocites mononucleares no olho do rato usando citometria de fluxo de vários parâmetros. CnV induzida a laser é o modelo padrão do mouse da AMD neovascular, que demonstrou a eficácia da terapia de AMD neovascular de primeira linha atual²¹. Este protocolo descreverá a enucleação dos olhos do rato, dissecção ocular, digestão em uma única suspensão celular, coloração de anticorpos, determinação de tensões a laser usando controles de cor única e estratégia de gating usando controles de fluorescência menos um (FMO). Para obter uma descrição detalhada do modelo CNV induzido por laser, consulte uma publicação anterior²². Usando este protocolo, definiremos microglias, monócitos, células dendríticas e populações de macrófagos. Além disso, usaremos MHCII e CD11c para definir ainda mais subconjuntos de macrófago dentro do modelo CNV induzido a laser.