氢-铀交换质谱仪（HDX-MS）平台，用于研究肽生物合成酶

蛋白质是结构动力学分子，在时间尺度上采样不同的构象，从女性到第二级的键振动到整个蛋白质域的重新排列，这些排列可以在多秒¹内发生。这些构象波动通常是酶/蛋白质功能的关键方面。例如，由配体结合引起的构象变化通常对于调节酶功能至关重要，无论是组织催化所需的活动站点残留物、在顺序动能机制中定义基板结合位点、保护反应中间体免受环境影响，还是通过全石器网络调节酶功能。最近的研究还表明，在整个进化过程中可以保存符合性动力学，而对保存分子运动的扰动可以与基质特异性的变化和新酶功能^2、3的出现相关。

近年来，氢-铀交换质谱仪（HDX-MS）迅速成为探索蛋白质构象景观如何对配体结合或突变^{4、5、6、7}等扰动做出反应的有力技术。在典型的HDX-MS实验（图1）中，一种感兴趣的蛋白质被放入D₂O制备的缓冲器中，这触发了可溶剂交换质子与 deuteria 的替代。肽债券的交换率在很大程度上取决于pH度、局部氨基酸序列和⁸号辣椒的局部结构环境。从事氢粘结相互作用的中位（如存在于α螺旋和β片中）的交换速度比暴露于散装溶剂的蛋白质非结构化区域中的中位要慢。因此，铀吸收的程度反映了酶的结构。符合动态的酶，或在配体结合后进行结构转换的酶，将有望产生可测量的HDX响应。

结构化中间体缓慢汇率的机械基础见图2^5、8、9。为了进行HDX，结构区域必须首先对展开的构象进行瞬时采样，以便通过特定的酸/碱基化学机制促进HDX交换的溶剂分子能够进入可交换的中间体。最终，化学汇率（k_化学）的相对幅度和折叠和重折叠率（k_打开和k_关闭）决定了实验^5、8中测量的HDX汇率。从这个简单的动能模型中，很明显，铀吸收的程度将反映潜在的构象动力学（如k_开和k_关闭的定义）。大多数HDX-MS实验都是在自下而上的工作流程中进行的，在交流反应之后，兴趣蛋白被消化成肽，每个肽的吸乳量被测量为质量⁷的增加。通过这种方式，HDX-MS 允许在肽的局部空间尺度上映射酶构象动力学的扰动，使研究人员能够评估扰动如何改变感兴趣的酶不同区域的动力学。

HDX-MS方法用于阐明蛋白质结构动力学的优点是多种多方面的。首先，该方法可以在具有第四纪结构¹⁰的系统中用少量的原生蛋白质或蛋白质复合物进行。只要自下而上的HDX-MS工作流程提供足够数量的自信识别肽，涵盖感兴趣的蛋白质^序列，就根本不需要在检测中使用的酶制剂进行^高度纯化。此外，HDX-MS可以提供近原生条件下的构象动力学信息，而无需像单分子荧光研究¹³中那样使用部位特异性蛋白质标签，并且对可以研究的蛋白质或蛋白质复合物没有大小限制（这使得核磁共振[NMR]光谱学等方法具有挑战性^）7，14。最后，可以采用时间解决的HDX-MS方法来研究内在紊乱的蛋白质，这些蛋白质很难用X射线晶体学^{15、16、17、18}来研究。HDX-MS 的主要限制是数据结构分辨率低。HDX-MS 数据可用于指出构象动力学的变化位置，并揭示耦合的构象变化，但它们通常不会提供对驱动观测变化的精确分子机制的深入了解。电子捕获分离方法与蛋白质HDX-MS数据相结合的最新进展表明，将交换点绘制为单一氨基酸残留物¹⁹有希望，但还需要进行后续生化和结构研究，以便为HDX-MS数据转发的结构模型提供清晰度。

下面，提出了一个详细的协议，为开发HDX-MS检测^是20。下面介绍的样品制备协议通常应适用于在水性缓冲中表现出良好溶解性的任何蛋白质。更专业的样品制备方法和HDX-MS工作流程可用于蛋白质比需要检测在洗涤剂或磷脂的存在21，22，23，24。HDX-MS 数据收集的仪器设置被描述为高分辨率四倍飞行时间质谱仪与液相色谱系统相结合。可以在一些市售的液相色谱-质谱 （LC-MS） 系统中的任何一个系统上收集具有类似复杂性和分辨率的数据。还提供了使用市售软件包进行数据处理的关键方面。此外，我们亦提供与更广泛的HDX-MS社区¹²的建议相一致的数据收集及分析指引。所述协议用于研究HalM2的动态结构特性，HalM2是一种促进抗菌肽天然产品²⁰的多步成熟。我们说明了如何使用 HDX-MS 来揭示基板绑定站点和未采用以前特征的异体特性。近年来，关于蛋白质HDX-MS的其他几项协议已经发表^25，26。结合目前的工作，这些早期的贡献应该为读者提供一些实验设计的灵活性。