Платформа масс-спектрометрии обмена водорода и дейтерия (HDX-MS) для изучения пептидных биосинтетических ферментов

Белки являются структурно динамические молекулы, которые образец различных конформаций на временных масштабах, начиная от фемтосекундного масштаба вибрации связи для перестановки целых белковых доменов, которые могут произойти в течение^{многих секунд 1}. Эти конформные колебания часто являются критическими аспектами функции фермента/белка. Например, конформациальные изменения, вызванные связыванием лигандов, часто критически важны для модуляции функции ферментов, либо путем организации активных остатков участка, необходимых для катализа, определения сайтов связывания субстрата в последовательных кинетических механизмах, защиты реактивных промежуточных веществ от окружающей среды, либо путем модуляции функции ферментов через алостерические сети. Недавние исследования также показали, что конформативная динамика может быть сохранена на протяжении всей эволюции и что возмущения к сохраненным молекулярным движениям могут быть коррелированы с изменениями в специфичности субстрата и появлением новых функций фермента^2,3.

В последние годы масс-спектрометрия обмена водородом-дейтерия (HDX-MS) быстро стала мощным методом для зондирования^того,как конформациальные ландшафты белка реагируют на возмущения, такие как связывание лиганда или мутагенез^4,5,6,7. В типичном эксперименте HDX-MS(рисунок 1),протеин интереса помещен в буфер подготовленный в D₂O, который вызывает замену растворителя-обменяемых протонов с deuteria. Скорость обмена амиде moiety пептидных связей сильно зависит от рН, местной аминокислотной последовательности, а также от местной структурной^{среды амиде 8}. Амидес, которые занимаются водородными взаимодействиями связи (например, присутствующих в α-хеликах и β-листах), обмениваются медленнее, чем амида в неструктурированных регионах белка, которые подвергаются воздействию растворителя. Таким образом, степень поглощения дейтерия является отражением структуры фермента. Ферменты, которые являются конформациально динамическими, или которые проходят структурные переходы на связывание лиганда, как ожидается, даст измеримый ответ HDX.

Механистическая основа медленного обменного курса структурированного амеда показана на рисунке 2^5,8,9. Для того, чтобы пройти HDX, структурированная область должна сначала временно попробовать развернутую конформацию, так что молекулы растворителя, которые катализингировать обмен HDX через определенный кислотный/базовый химический механизм, имеют доступ к обмениваемому амиду. В конечном счете, относительные величины химического обменного курса(k_chem)и скорость складывания и складывания(k_open и k_close)определяют курс HDX, измеренный в^{эксперименте 5,8}. Из этой простой кинетической модели ясно, что степень поглощения дейтерия будет отражать лежащую в основе конформацию динамики (определяемую k_open и k_close). Большинство экспериментов HDX-MS проводятся в рабочем процессе снизу вверх, где, после реакции обмена, белок интереса переваривается в пептиды и поглощение дейтерия каждым пептидом измеряется как увеличение^{массы 7}. Таким образом, HDX-MS позволяет сопоставить возмущения с ферментной конформациальной динамикой на локальном пространственном масштабе пептидов, что позволяет исследователю оценить, как возмущение изменяет динамику в различных областях фермента, представляющих интерес.

Преимущества подхода HDX-MS для выяснения структурной динамики белка многочисленны. Во-первых, метод может быть выполнен с небольшим количеством родного белка или на белковых комплексах в системах с четвертичных структур^10. Это даже не обязательно для фермента препарат, используемый в^{анализе, чтобы быть высоко очищены 11,12}, до тех пор, как снизу вверх HDX-MS рабочий процесс обеспечивает достаточное количество уверенно определены пептиды, которые охватывают белковую последовательность интереса. Кроме того, HDX-MS может предоставить информацию о конформации динамики в почти родных условиях без необходимости для сайта конкретных белковой маркировки, как будет использоваться в одной молекулы^{флуоресценции исследований 13}, и нет предела размера белка или белкового^{комплекса,}которые могут быть исследованы (что делает подходы, такие как ядерный магнитный резонанс “NMR” спектроскопии^{сложной) 7},¹⁴. Наконец, время решены HDX-MS методы могут быть использованы для изучения внутренне неупорядоченых белков, которые трудно изучить с рентгеновской^{кристаллографии 15,16,17,18}. Основным ограничением HDX-MS является то, что данные имеют низкое структурное разрешение. Данные HDX-MS полезны для указания на то, где меняется конформациальная динамика, и для выявления связанных конформных изменений, но они не часто дают большое представление о точном молекулярном механизме, обуговающем наблюдаемое изменение. Недавние достижения в сочетании методов диссоциации захвата электронов с данными белка HDX-MS показали обещание для картирования сайтов обмена на одиночные^{аминокислотные остатки 19,}но последующие биохимические и структурные исследования все еще часто необходимы, чтобы обеспечить ясность структурных моделей, переадресуемых данными HDX-MS.

Ниже представлен подробный протокол для разработки анализа HDX-MS²⁰. Протоколы подготовки образца, представленные ниже, должны быть в целом применимы к любому белку, который демонстрирует хорошую жалкость в aqueous буферах. Более специализированные методы подготовки образца и HDX-MS рабочие процессы доступны для^{белков,}чем нужно провести анализ в присутствии моющего средства или^{фосфолипидов 21,22},^23,24. Инструментальные настройки для сбора данных HDX-MS описаны для четырехугольного масс-спектрометра высокого разрешения в сочетании с жидкой хроматографической системой. Данные аналогичной сложности и разрешения могут быть собраны на любой из ряда коммерчески доступных жидкой хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS) систем. Предоставляются также ключевые аспекты обработки данных с использованием коммерчески доступного пакета программного обеспечения. Мы также представляем руководящие принципы для сбора и анализа данных, которые соответствуют рекомендациям, сделанным более широким сообществом HDX-MS^12. Описанный протокол используется для изучения динамических структурных свойств HalM2, лантипептид синтетазы, которая катализа multistep созревания антимикробного пептида натуральный^{продукт 20}. Мы иллюстрировать, как HDX-MS может быть использован для выявление сайтов связывания субстрата и алостерических свойств, которые ускользали от предыдущей характеристики. Несколько других протоколов по белку HDX-MS были опубликованы в последние^{годы 25,26}. Вместе с настоящей работой, эти более предыдущие вклады должны обеспечить читателю некоторую гибкость в экспериментальном конструкции.