Une plate-forme de spectrométrie de masse d’échange hydrogène-deutérium (HDX-MS) pour étudier les enzymes biosynthétiques peptidiques

Les protéines sont des molécules structurellement dynamiques qui échantillonnent différentes conformations sur des échelles de temps allant des vibrations des liaisons femtosecondes aux réarrangements de domaines protéiques entiers qui peuvent se produire sur plusieurs secondes¹. Ces fluctuations conformationnelles sont souvent des aspects critiques de la fonction enzymatique/protéique. Par exemple, les changements conformationnels induits par la liaison ligand sont souvent d’une importance cruciale pour moduler la fonction enzymatique, soit en organisant les résidus actifs du site nécessaires à la catalyse, en définissant les sites de liaison du substrat dans les mécanismes cinétiques séquentiels, en protégeant les intermédiaires réactifs de l’environnement, soit en modulant la fonction enzymatique par l’intermédiaire de réseaux allotériques. Des études récentes ont également montré que la dynamique conformationnelle peut être conservée tout au long de l’évolution et que les perturbations des mouvements moléculaires conservés peuvent être corrélées avec des changements dans la spécificité du substrat et l’émergence de nouvelles fonctions enzymatiques^2,3.

Ces dernières années, la spectrométrie de masse d’échange hydrogène-deutérium (HDX-MS) est rapidement apparue comme une technique puissante pour sonder la façon dont les paysages conformationnels protéiques réagissent aux perturbations telles que la liaison ligand ou la mutagenèse^4,5,6,7. Dans une expérience typique de HDX-MS (figure 1), une protéine d’intérêt est placée dans le tampon préparé dans D₂O, ce qui déclenche le remplacement des protons échangeables de solvants par deutérium. Le taux de change de l’amide moiety des liaisons peptidiques dépend fortement du pH, de la séquence locale d’acides aminés, et de l’environnement structurel local de l’amide⁸. Les amidons engagés dans des interactions de liaison hydrogène (comme celles présentes dans les α-hélices et les feuilles de β) s’échangent plus lentement que les amides dans les régions non structurées de la protéine qui sont exposées au solvant en vrac. Ainsi, l’étendue de l’absorption de deutérium est un reflet de la structure de l’enzyme. On s’attendrait à ce que les enzymes qui sont conformationally dynamiques, ou qui subissent des transitions structurelles sur la liaison ligand, produisent une réponse mesurable de HDX.

La base mécaniste du taux de change lent d’un amide structuré est indiquée dans la figure 2^5,8,9. Pour subir le HDX, la région structurée doit d’abord échantillonner transitoirement une conformation dépliée, de sorte que les molécules solvantes qui catalysent l’échange HDX via un mécanisme chimique acide/de base spécifique, aient accès à l’amide échangeable. En fin de compte, les magnitudes relatives du taux de change chimique (k_chem) et les taux de pliage et de refolding (k_ouvert et k_fermer) déterminer le taux HDX mesuré dans l’expérience^5,8. De ce modèle cinétique simple, il est clair que l’étendue de l’absorption de deutérium reflétera la dynamique conformationnelle sous-jacente (telle que définie par k_ouvert et k_fermer). La plupart des expériences HDX-MS sont réalisées dans un flux de travail ascendant où, suite à la réaction d’échange, la protéine d’intérêt est digérée en peptides et l’absorption de deutérium par chaque peptide est mesurée comme une augmentation de la masse⁷. De cette façon, HDX-MS permet de cartographier les perturbations de la dynamique conformationnelle des enzymes à l’échelle spatiale locale des peptides, ce qui permet au chercheur d’évaluer comment la perturbation modifie la dynamique dans différentes régions de l’enzyme d’intérêt.

Les avantages de l’approche HDX-MS pour élucider la dynamique structurelle des protéines sont nombreux. Tout d’abord, la méthode peut être effectuée avec de petites quantités de protéines indigènes ou sur des complexes protéiques dans des systèmes à structure quaternaire¹⁰. Il n’est même pas nécessaire que la préparation enzymatique utilisée dans l’analyse soit fortement purifiée^11,12, tant que le flux de travail HDX-MS ascendant fournit un nombre suffisant de peptides identifiés avec confiance qui couvrent la séquence protéique d’intérêt. En outre, HDX-MS peut fournir des informations sur la dynamique conformationnelle dans des conditions quasi natives sans avoir besoin d’étiquetage protéique spécifique au site comme cela serait utilisé dans les études de fluorescence à molécule^{unique 13}, et il n’y a pas de limite de taille au complexe protéique ou protéique qui peut être étudié (ce qui rend difficiles des approches telles que la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire [NMR])^7,14. Enfin, des méthodes HDX-MS résolues dans le temps peuvent être utilisées pour étudier les protéines intrinsèquement désordonnées, qui sont difficiles à étudier avec la cristallographie aux rayons X^15,16,17,18. La principale limitation de HDX-MS est que les données sont de faible résolution structurelle. Les données HDX-MS sont utiles pour indiquer où la dynamique conformationnelle évolue et pour révéler des changements conformationnels couplés, mais elles ne fournissent pas souvent beaucoup d’informations sur le mécanisme moléculaire précis qui conduit au changement observé. Les progrès récents dans la combinaison des méthodes de dissociation de capture d’électrons avec les données de protéine HDX-MS se sont révélés prometteurs pour cartographier les sites d’échange aux résidus d’acides aminés^{simples 19}, mais le suivi des études biochimiques et structurelles sont encore souvent nécessaires pour fournir la clarté aux modèles structurels transmis par les données HDX-MS.

Ci-dessous, un protocole détaillé pour le développement d’un essai HDX-MS est présenté²⁰. Les protocoles de préparation de l’échantillon présentés ci-dessous devraient être généralement applicables à toute protéine qui présente une bonne solubilité dans les tampons aqueux. Des méthodes de préparation d’échantillons plus spécialisées et des workflows HDX-MS sont disponibles pour les protéines que nécessaire en présence de détergent ou de phospholipides^21,22,23,24. Les paramètres instrumentaux de collecte de données HDX-MS sont décrits pour un spectromètre de masse quadrupole haute résolution couplé au système de chromatographie liquide. Des données d’une complexité et d’une résolution similaires pourraient être recueillies sur l’un ou l’autre d’un certain nombre de systèmes de spectrométrie de masse chromatographie liquide (LC-MS) disponibles dans le commerce. Des aspects clés du traitement des données à l’aide d’un logiciel disponible dans le commerce sont également fournis. Nous présentons également des lignes directrices pour la collecte et l’analyse des données qui sont conformes aux recommandations formulées par l’ensemble de la communauté HDX-MS¹². Le protocole décrit est utilisé pour étudier les propriétés structurelles dynamiques de HalM2, une synthétase lanthipeptide qui catalyse la maturation en plusieurs étapes d’un produit naturel peptidique antimicrobien²⁰. Nous montrons comment HDX-MS peut être utilisé pour révéler les sites de liaison du substrat et les propriétés allostériques qui ont échappé à la caractérisation précédente. Plusieurs autres protocoles sur la protéine HDX-MS ont été publiés ces dernières années^25,26. Avec le présent travail, ces contributions antérieures devraient fournir au lecteur une certaine flexibilité dans la conception expérimentale.