In vivo rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (IV-FPOP) er en hydroksylradikal proteinfotavtrykksteknikk som gjør det mulig å kartlegge proteinstruktur i sitt eget miljø. Denne protokollen beskriver montering og oppsett av IV-FPOP mikrofluidic flow system.
Rask oksidasjon av proteiner (FPOP) er en hydroksylradikal proteinfotavtrykk (HRPF) metode som brukes til å studere proteinstruktur, protein-ligand interaksjoner og proteinproteininteraksjoner. FPOP benytter en KrF excimer laser på 248 nm for fotolysse av hydrogenperoksid for å generere hydroksylradikaler som igjen oksidativt modifiserer løsemiddel-tilgjengelige aminosyre sidekjeder. Nylig utvidet vi bruken av FPOP av in vivo oksidativ merking i Caenorhabditis elegans (C. elegans), med tittelen IV-FPOP. De gjennomsiktige nematodene har blitt brukt som modellsystemer for mange menneskelige sykdommer. Strukturelle studier i C. elegans av IV-FPOP er mulig på grunn av dyrets evne til å ta opp hydrogenperoksid, deres åpenhet til laserbestråling på 248 nm, og den irreversible karakteren av modifikasjonen. Monteringen av et mikrofluidisk strømningssystem for IV-FPOP-merking, IV-FPOP-parametere, proteinekstraksjon og LC-MS/MS-optimaliserte parametere er beskrevet heri.
Proteinfotavtrykk kombinert med massespektrometri (MS) har blitt brukt de siste årene til å studere proteininteraksjoner og konformasjonsendringer. Hydrokylradikal proteinfotavtrykk (HRPF) metoder probeprotein løsemiddel tilgjengelighet ved å modifisere protein aminosyre sidekjeder. HRPF-metoden, rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (FPOP)1, har blitt brukt til å undersøke proteinstruktur in vitro2,in-cell (IC-FPOP)3, og senest in vivo (IV-FPOP)4. FPOP benytter en 248 nm bølgelengde excimer laser for å raskt generere hydroksyl radikaler ved fotolysse av hydrogenperoksid for å danne hydroksylradikaler1. I sin tur kan disse radikalerne merke 19 av 20 aminosyrer på en mikrosekund tidsskala, raskere enn proteiner kan utfolde seg. Selv om reaktiviteten til hver aminosyre med hydroksylradikaler strekker seg 1000 ganger, er det mulig å normalisere sidekjedeoksidasjon ved å beregne en beskyttelsesfaktor (PF)5.
Siden FPOP kan oksidativt modifisere proteiner uavhengig av størrelse eller primærsekvens, viser det seg å være en fordel for in-cell og in vivo proteinstudier. IV-FPOP prober proteinstruktur i C. elegans på samme måte som in vitro og in-cell studier4. C. elegans er en del av nematodefamilien og er mye brukt som modell for å studere menneskelige sykdommer. Ormens evne til å ta opp hydrogenperoksid ved både passiv og aktiv diffusjon gjør det mulig å studere proteinstruktur i forskjellige kroppssystemer. I tillegg er C. elegans egnet for IV-FPOP på grunn av deres gjennomsiktighet på 248 nm laser bølgelengde som trengs for FPOP6. Kobling av denne metoden til massespektrometri gjør det mulig å identifisere flere modifiserte proteiner ved hjelp av tradisjonelle nedenfra og opp proteomics tilnærminger.
I denne protokollen beskriver vi hvordan du utfører IV-FPOP for analyse av proteinstruktur i C. elegans. Den eksperimentelle protokollen krever montering og oppsett av mikrofluidic flow system for IV-FPOP tilpasset fra Konermann et al7. Etter IV-FPOP er prøvene homogenisert for proteinekstraksjon. Proteinprøver proteolyzed og peptider analyseres av flytende kromatograf (LC) tandem MS, etterfulgt av kvantifisering.
Den nåværende referansen for studiet av in vivo protein-protein interaksjoner (PPI) er fluorescens resonans energioverføring (FRET). I sin enkleste form studerer denne teknikken PPI ved energioverføring mellom to molekyler når de er i nærheten av hverandre15. I motsetning til MS-teknikker har FRET ikke oppløsning en karakterisering av konformasjonsendringer og interaksjonssteder på aminosyrenivå. MS-baserte teknikker har i økende grad blitt brukt til studiet av PPI16. IV-FPOP er en HRPF-metode som muliggjør in vivo protein strukturell analyse i C. elegans. For å kunne merke C. elegans av IV-FPOP, er det viktig å montere mikrofluidic flow-systemet på riktig måte for å redusere prøvetap. Den 250 μm i.d. kapillær har vist seg å maksimere prøveutvinning sammenlignet med mindre i.d. kapillærer4. Større i.d. kapillærer har ikke blitt testet, men det mikrofluidiske strømningssystemet er utformet ved hjelp av en kapillær med samme i.d. som et kommersielt tilgjengelig flytcytometrisystem for sortering av C. elegans. 17 Ormprøvestørrelsen er også viktig, en prøvestørrelse på mindre enn ~ 10 000 per prøve før FPOP gir ikke proteinkonsentrasjoner høyt nok for LC-MS/MS-analyse. Høyere prøvestørrelser (> 10 000 ormer) kan også brukes ved å justere det opprinnelige startvolumet (trinn 4.5).
Riktig montering av mikrofluidic flow system er viktig. Lekkasjer i prøvebanen resulterer i en inkonsekvent strøm av ormene eller H2O2. Ferrules, ermer og 3-2 ventiler kan gjenbrukes fra flere IV-FPOP eksperimenter hvis riktig rengjort etter hvert eksperiment. Vi anbefaler imidlertid å sette sammen et nytt mikrofluidisk strømningssystem for hver biologisk elikm. Hvis mikrofluidics er riktig montert, vil ormene og H2O2 blande senk ved blanding-T med minimalt ryggtrykk. Som kvalitetskontroll (QC) av mikrofluidic flow system, anbefaler vi teste blandeeffektiviteten ved hjelp av fargede fargestoffer. Det er viktig å overvåke bevegelsen til de magnetiske omrørerne inne i ormsprøyten under IV-FPOP, feil prøveblanding i ormsprøyten eller blandingen-T kan føre til at bakgrunnstrykket forårsaker lekkasjer. I tillegg fører dårlige blandeforhold til store prøvetap, dårlig lasereksponering av ormer ved laservinduet og tilstopping.
C. elegans vedlikehold er viktig for å redusere bakgrunnsoksidasjon. Vi anbefaler at du vokser ormene ved lave temperaturer under lave stressforhold, da høye temperaturer kan påvirke total bakgrunnsoksidasjon. En kontrollprøve sett med ormer bare, ingen H2O2 og ingen laserbestråling, anbefales for alle IV-FPOP eksperimenter for å ta hensyn til bakgrunnsoksidasjon på grunn av laboratorievedlikehold. En av dagens begrensninger i denne teknikken er totalt antall oksidativt modifiserte peptider identifisert og det totale antall rester oksidert per peptid for å få høyere protein strukturell informasjon. Selv om det ikke anbefales, kan en økning i oksidative modifikasjoner oppnås ved å bruke høyere konsentrasjoner av hydrogenperoksid. En økning i hydrogenperoksid kan betydelig endre viktige biologiske veier samt føre til oksidasjonsindusert utfolder. Hvis hydrogenperoksidkonsentrasjonen for IV-FPOP økes, anbefales det å teste ormlevedyktighet og bakgrunnsoksidasjon, da konsentrasjoner høyere enn 200 mM ikke er testet.
LC-MS/MS-protokollen som er beskrevet, kan optimaliseres og endres for å møte MS QC for andre laboratorier. Bruken av 2D-kromatografiteknikker har tidligere vist seg å øke identifiseringen av oksidativt modifiserte peptider og proteiner18. Likevel er proteinberikelsesteknikker som retter seg mot et bestemt protein av interesse, ikke anbefalt, inkludert, men ikke begrenset til antistoffnedbør eller nedtrekksanalyser. Disse teknikkene kan forutse mot en proteinconformer hvis epitope / bindende stedet for proteinet har blitt oksidativt modifisert av IV-FPOP. Nye utviklinger i fotavtrykk radikale reagenser, som sulfat radikal anion10 eller trifluoromethylation19 kan øke allsidigheten av IV-FPOP. Selv om den eneste merking reagens testet in vivo så langt er hydrogenperoksid, andre laser-aktivert radikaler kan optimaliseres. Bruken av andre radikaler bør vise seg å være kompatibel med orm levedyktighet, celle gjennomtrengelig, og 248 nm laser bølgelengde. På grunn av bruk av C. elegans som modellsystem for mange menneskelige sykdommer, iv-FPOP har potensial til å ha en sterk innvirkning i å studere rollen protein struktur i sykdom patogenese.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av oppstartsmidler fra University of Maryland, Baltimore og NIH 1R01 GM 127595 tildelt LMJ. Forfatterne takker Dr. Daniel Deredge for hans hjelp til å redigere manuskriptet.
15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | 2 minimum |
60 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FM3279 | This item is no longer available. Any low-volume sonicator will be sufficient |
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ||
Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
Dissecting Needle | Fisher Scientific | 50-822-525 | only a couple are needed |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
Epoxy instant mix 5 minute | Loctite | 1365868 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-100 | |
EX350 excimer laser (248 nm wavelength) | GAM Laser | ||
FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Sciene | 1548L | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | 2 minimum |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
Legato 101 syringe pump | KD Scientific | 788101 | |
Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Sciene | P-618L | 2 minimum |
Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M65-500 | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x1.6"' | IDEX Health & Sciene | F-242X | |
NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Sciene | F-246 | |
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
OmniPur Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 7110-OP | any protease inhibitor is sufficient |
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used | |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 250µm, Outer Diameter 350µm, TSP250350 | Polymicro Technologies | 1068150026 | |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450µm, Outer Diameter 670µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75µm, Outer Diameter 375µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
Proteome Discover (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
Scissors | Fisher Scientific | 50-111-1315 | any scissors are sufficient |
Self-Adhesive Label Tape | Fisher Scientific | 15937 | one roll is sufficient |
Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes | Fisher Scientific | 05-402 | any brand is sufficient |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | 15-525-017 | |
Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | |
Stereo Zoom Microscope | Fisher Scientific | 03-000-014 | a magnifying glass is sufficient |
Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Sciene | P-259X | |
Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Sciene | P-255X | |
Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
Universal Base Plate, 2.5" x 2.5" x 3/8" | Thorlabs Inc. | UBP2 | |
Urea | Fisher Scientific | U5378 | |
VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Sciene | UH-436 | 2 minimum |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |