在Vivo羟基基蛋白足迹研究卡诺哈布迪特人的蛋白质相互作用

1. C. elegans维护和文化 按照标准实验室程序8，将蠕虫菌群生长并同步到其第四个幼虫（L4）阶段。 IV-FPOP实验当天，用M9缓冲液（0.02 M KH2PO 4、0.08 M Na2HPO4、0.08M NaCl、1 mM MgSO 4）从细菌草坪（OP50大肠杆菌）清洗L4蠕虫。4 每个 IV-FPOP 样本获取 ±10，000 蠕虫的 500 μL 等位。 2. 微流体流系统组件 切割一块 2 厘米的氟乙烯丙烯 （FEP） 管（1/16 英寸外径 （o.d.） x 0.020 英寸内径 （i.d.））启动流系统组件。 使用干净的解剖针，扩大FEP管的i.d.，以便一端只形成一个小陨石坑，长度为±50毫米。陨石坑应该足够大，可以容纳两块360μmo.d.的熔融石英。注：不要加宽相反的一端，因为此端将仅用于安装出口毛细管。 使用陶瓷切割机，切割两块 15 厘米的 250 μm i.d. 熔融石英。这两块将成为流系统的注入线。 使用自粘胶带，将两个 250 μm i.d. 毛细血管粘在一起，确保它们彼此平行，其末端 100% 冲洗。注：为确保熔融的二氧化硅端在切割后不会粉碎，并且彼此直和 100% 冲洗，建议使用放大镜或立体显微镜检查它们。 将两个带胶带的毛细血管插入 FEP 管的手工坑中。将毛细血管推到手工陨石坑的边缘。注意：为了保持流系统的功效，不要推过手工制作的陨石坑（图1a）。 将一小块环氧树脂放在干净的表面上，并与解剖针混合。 快速，使用相同的针头，在注入毛细血管的末端放置一小滴树脂，与 FEP 管连接，让树脂干燥，将出口侧向上悬挂几分钟（图 1a）。 当树脂干燥时，将 FEP 管和两个毛细管结合在一起，切出新的 250 μm i.d. 毛细管。新的毛细管将成为流动系统的出水毛细管。可以使用以下方程计算所需的毛细管长度：如果 l 的长度以厘米为单位，t是所需的反应时间（以分钟为单位），f以 mL/min 为单位的流速，并且 i.d. 毛细管的内径（以厘米为单位）。注：切割出出口毛细管后，检查末端，确保它们是直的，而不是粉碎的。 树脂干燥后，通过 FEP 管出口端插入新的毛细管。出口毛细管的内端和两个注入毛细血管应在 FEP 管内相互冲洗，这会产生混合-T（图 1b）。 按照步骤 2.6 和 2.7 中所述，将出口毛细管和 FEP 管与新鲜的环氧树脂结合。 让树脂在一夜之间干燥，将流系统结合在一起。第二天设置微流体流系统（图1c）。 3. 用于体内FPOP的微流体流系统 在一个 5 mL 注射器内插入四个磁性搅拌器。此注射器成为注射器样本。磁性搅拌器可防止蠕虫在IV-FPOP期间在注射器内沉降（图2A）。 用 M9 填充两个 5 mL 注射器。确保每个注射器内没有气泡，因为它们会影响流速和混合效率。 将 Luer 适配器连接到每个 5 mL 注射器，确保它们手指紧，并固定到位。 将每个注射器连接到一个 3-2 阀。注射器应连接到阀门的中间端口（图2B）。 将每个 5 mL 注射器固定到双注射器泵，并调整机械止动圈，以防止从推杆块向注射器施加过压。在设置止动环时，请记住添加磁性搅拌器。 使用超级球形螺母、FEP 套筒和超级球杆套管将自制微流体流系统的每个注入毛细管端连接到每个 3-2 阀的顶部端口（图 2B）。 到3-2阀（底部端口）的剩余打开端口，使用超级瓶螺母、FEP套筒和超级跳蚤套（图2B）连接10厘米450μm的毛细管。这些毛细血管成为提取的样品毛细血管。 启动泵流量并检查微流体流系统的所有连接，有无目视泄漏。使用实验流速至少流动三个注射器体积。最终流速取决于激光照射窗口、激光频率和零排位分数体积。注：对于此协议，从激光照射窗口 2.55 mm、250 μm i.d.熔融石英、零排除分数和 50 Hz 频率计算了最终流速 375.52 μL/min。 流道由 3-2 阀手柄上的箭头标记。通过将阀手柄从排出位置移到回退位置，可以手动重新填充每个注射器。注：3-2 阀处的泄漏可以通过重新拧入超级阀螺母或更换任何阀连接（超级跳蚤螺母、FEP 套筒或超级滚圈套）来修复。混合-T 处的泄漏需要重新组装微流体流系统（步骤 2.1 到 2.11）。 将微流体流系统移到实验台，并使用 360 μm o.d. 不锈钢联合将出口毛细管固定到辐射阶段（图 2Figure 2C，D）。 使用长距离打火机，在激光照射窗口燃烧熔融石英的涂层。使用无绒组织和甲醇清洁燃烧的涂层。注：在燃烧周期和甲醇清洗周期之间交替，以避免毛细管过热，因为多余的热量会融化和/或打破毛细管。 将磁性搅拌器块置于包含磁性搅拌器的 5 mL 注射器上方。调整磁搅拌器块的速度和位置，使 5 mL 注射器内的磁性搅拌器缓慢而持续地旋转。 4. 体内 FPOP 打开 KrF 兴奋激光器，让胸腺预热。注意：激光以248nm波长发出可见和不可见的辐射，可能损害眼睛。在打开激光并打开光束出口窗口之前，应佩戴适当的护眼。 通过将光学传感器放在光束出口窗口，测量至少 100 个脉冲的频率为 50 Hz 的激光能量。注：对于此协议，使用激光能量为 150 ± 2.32 mJ 的 2.55 mm 辐照窗口。 获取大约 10，000 个蠕虫（500 μL），然后手动将样品提取到样品注射器中。 将样品注射器填充 2.5 mL M9 缓冲液，最终采样体积为 3 mL。确保样品注射器中未引入气泡。 将第二个注射器填充 3 mL 的 200 mM H2O2，再次确保注射器中未引入气泡。 在出口毛细管的末端， 放置一个15 mL锥形管包裹在铝箔中，含有6 mL的40 mM N’-二甲基硫柳体（DMTU），40 mM N-tert-丁基-β-苯基硝基（PBN），和1%二甲基硫氧化物，分别淬火过量的H2O2，羟基，并抑制二氧化二氧化碳还原酶活性。 从软件窗口启动兴奋激光器，等待第一个脉冲，然后从双注射器启动样品流。注：样品应在3种样品条件下以生物复制品进行技术三联：H2O2（样品）激光照射，无H2O2激光照射，无H2O2（控制）激光照射，每组生物组共9个样品。 在 15 mL 管中收集整个样品，同时主动监控样品流量，防止任何视觉泄漏，因为样品注射器的一些背压有时会积聚。 IV-FPOP 后，颗粒蠕虫在 805 x g上离心 2 分钟。去除淬火溶液，加入 250 μL 裂解缓冲液（8 M 尿素，0.5% SDS，50 mM HEPES，50 mM NaCl，1 mM EDTA，1 mM 苯甲二硫化氟化物 [PMSF]）。将样品转移到干净的微离心管中，闪速冻结，并储存在-80°C，直到样品消化。 5. 蛋白质提取、纯化和蛋白质解 解冻冰冻样品在冰上，通过声波均匀10s，然后60s冰孵育。可能需要多轮声波，通过在显微镜幻灯片上放置 2 μL 样品等值，可以在立体显微镜下观察到均质。当看到小到没有蠕虫时，样品均质化是完整的。 在 4°C 下以 400 x g的离心化蠕虫 5 分钟，并将上清液收集到干净的微离心管中。 使用双仁蛋白酸测定（BCA测定）使用制造商的说明确定样品蛋白浓度。注：样品浓度可以使用任何生化蛋白浓度测定选择来确定。请记住试剂与裂化缓冲液的兼容性（8 M 尿素、0.5% SDS、50 mM HEPES、50 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM PMSF）。此外，可能需要稀释缓冲液。 从每个样品中获取100微克蛋白质，并放置在干净的微离心管中。 将二硫硫醇 （DTT） 添加到 10 mM 的最终浓度中，以减少所有样品中的二硫化物键。涡旋，向下旋转，在50°C下孵化样品45分钟。 将样品冷却至室温 10 分钟。 将碘酰胺 （IAA） 添加到 50 mM 的最终浓度中，以降低残留物的酸化。在室温下，在室温下，涡旋、减速和孵育样品20分钟，防止光线照射。 在烷基化后，立即加入4卷100%预冷却丙酮，并在-20°C孵育过夜，从而沉淀蛋白质样品。 第二天，颗粒蛋白在16，000 x g的离心沉淀下沉淀10分钟。 用90%丙酮清洗样品颗粒，去除上清液，让颗粒干燥2~3分钟。 在 25 mM Tris-HCl （1 μg/μL） 中重新悬浮蛋白质颗粒。在最终蛋白酶与蛋白质比为1：50（w/w）时加入胰蛋白酶，并在37°C下消化样品过夜。 第二天，通过加入5%的酸，来抑制胰蛋白酶消化反应。注：LC-MS/MS 分析（步骤 6.1-6.5）每个样品至少需要 0.5 μg 的肽。使用定量色度肽测定（参见材料表）确定样品肽浓度，如制造商的协议所述。 6. 高性能液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS） 使用以下 LC 移动相：0.1% FA （A） 中的水，0.1% FA （B） 中的 ACN 中的水。 将0.5 μg肽加载到含有C18（5 μm，100°）的陷阱柱上，用99%溶剂A和1%B清洗样品15分钟，15 μL/min流速。 使用内部包装柱（0.075 毫米 i.d. = 20 mm）与 C18 反向相材料（5 μm，125°）分离肽。 使用以下分析分离方法：梯度以 300 nL/min 泵送 120 分钟：0~1 分钟，3% B;2~90分钟，10~45%B;100~105分钟，100%B;106~120 分钟，3% B. 使用高分辨率质谱仪在正电拉模式下对肽进行数据采集， 纳米电喷雾电电化 （nESI）。注：对于此协议，使用了超高性能 LC （UPLC） 仪器耦合到高分辨率质谱仪。利用数据依赖获取。MS1 的 m/z 扫描范围为 3750~1500，分辨率为 60，000，动态排除为 60。不包括电荷状态为 +1 和 >6 的离子。使用 5.5e5 的自动增益控制 （AGC） 目标，最大喷射时间为 50 ms，强度阈值为 5.5e4。为 MS2 选择的离子使用 32% 的规范化碰撞能量受到高能碰撞分离 （HCD） 碎片。在光谱仪中检测到具有 15，000 分辨率和 5.0e4 AGC 目标的片段离子。 7. 数据分析 使用自下而上的蛋白质组学分析软件搜索针对C. elegans数据库的串联 MS 文件。 将蛋白质分析搜索参数设置为如下：一个胰蛋白酶缺失裂解，375~1500 m/z肽质量范围，片段质量公差0.02，前体质量公差为10 ppm。卡酰胺甲基化被设置为静态修饰，众所周知羟基基侧链修饰99，1010为动态。肽识别在 95% 置信度（中等）和残留 99% 置信度（高）处确定。错误发现率 （FDR） 设置为 1%。 将数据导出到电子数据库，并使用以下11的方程汇总每个肽或残留物的氧化程度：注：其中EIC区域修改是肽或具有氧化改性残留物的提取的电子色谱面积（EIC），而EIC区域是同一肽或残留物的总面积，有无氧化修饰。