In Vivo Hidroksil Radikal Protein Ayak İzi Caenorhabditis elegans Protein Etkileşimleri Çalışması için

1. C. elegans bakım ve kültür Büyümek ve standart laboratuvar prosedürleri 8 aşağıdaki dördüncü larva (L4) aşamasına solucan kolonileri senkronize. IV-FPOP deney günü, Bakteriyel çimenlerden L4 solucanları yıkayın (OP50 E. coli)M9 tampon (0.02 M KH2PO4, 0.08 M Na2HPO4, 0.08 M NaCl, 1 mM MgSO4). IV-FPOP numunesi başına ~10.000 solucanın 500 μL aliquot’u edinin. 2. Mikroakışkan akış sistemi montajı 2 cm’lik florlu etilen propilen (FEP) boru (1/16 in. dış çap (o.d.) x 0,020 iç çapı (i.d.)) keserek akış sistemi montajını başlatın. Temiz bir kesme iğnesi kullanarak, FEP borularının iliğini genişleterek sadece bir ucunda küçük bir krater, ~50 mm uzunluğunda olun. Krater, erimiş iki adet 360 μm o.d. parçasını sığdıracak kadar büyük olmalıdır.NOT: Bu uç sadece çıkış kılcal sığdırmak için kullanılacak gibi ters ucu genişletmeyin. Bir seramik kesici ile, 250 μm i.d. erimiş silika iki 15 cm adet kesti. Bu iki parça akış sisteminin infüzyon hatları olacak. Kendinden yapışkanlı bant kullanarak, iki 250 μm i.d. kılcal damarları birbirine paralel ve uçları0 kızartılır sağlamak için bantlayın.NOT: Erimiş silika uçlarının kesimden sonra ezilememesi ve düz ve 0 birbirine kızarmaması için büyüteç le veya stereo mikroskop altında incelenmesi tavsiye edilir. İki bantlı kılcal damarı FEP borunun el yapımı kraterine takın. Kılcal damarları el yapımı kraterin kenarına doğru itin.DİkKAT: Akış sisteminin etkinliğini korumak için, el yapımı kraterin ötesine itmeyin (Şekil 1a). Temiz bir yüzeye epoksi reçine küçük bir nokta yerleştirin ve bir kesme iğnesi ile karıştırın. Hızlı bir şekilde, aynı iğneyi kullanarak, FEP tüpü ile bağlanan ve rekarin kurumasını sağlamak, çıkış tarafı kadar asılı, birkaç dakika için infüzyon kılcal damarların sonuna rezorin küçük bir damla yerleştirin(Şekil 1a). Rezorin kururken, FEP tüpü ve iki kılcal damarı birbirine bağlayarak, yeni bir 250 μm i.d. kılcal damar ı kesin. Yeni kılcal akış sisteminin çıkış kılcal olacak. Kılcal damarın istenilen uzunluğu aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplanabilir:L santimetre olarak kesilecek kılcal damar uzunluğu, t dakika içinde istenilen reaksiyon süresi, f mL /min akış hızı, i.d. santimetre olarak kapiller iç çapıdır.NOT: Çıkış kılcal damarını kestikten sonra uçları düz ve ezmemesini sağlayarak inceleyin. Rezorin kuruduktan sonra, fep boru çıkış ucundan yeni kılcal yerleştirin. Çıkış kılcal ve iki infusing kılcal damarların iç uçları FEP tüpü içinde birbirlerine karşı floş olmalıdır, bu karıştırma-T oluşturur (Şekil 1b). 2.6 ve 2.7 adımlarında açıklandığı gibi çıkış kılcal damarını ve FEP tüplerini taze epoksi reçine ile bağlayın. Reişin bir gecede kurumasını bekleyin ve akış sistemini birbirine bağlayın. Ertesi gün mikroakışkan akış sistemini kurmak(Şekil 1c). 3. In vivo FPOP için mikroakışkan akış sistemi Bir 5 mL şırınganın içine dört manyetik karıştırıcı yerleştirin. Bu şırınga örnek şırınga olur. Manyetik karıştırıcılar IV-FPOP sırasında şırınga nın içine yerleşen solucanları önler (Şekil 2A). İki 5 mL şırıngayı M9 ile doldurun. Onlar akış hızı ve karıştırma verimliliği etkileyebilir gibi her şırınga içinde hiçbir hava kabarcıkları olduğundan emin olun. Luer adaptörünü her 5 mL şırıngaya bağlayın ve parmaklarını sıkıca sıkıtutun ve yerinde sabitlenin. Her şırıngayı tek bir 3-2 valfine takın. Şırınga vananın orta noktasına takılmalıdır(Şekil 2B). Her 5 mL şırıngayı çift şırınga pompasına sabitleyin ve itici bloğundan şırınganın aşırı basıncını önlemek için mekanik stop yakasını ayarlayın. Stop yakasını ayarlarken manyetik karıştırıcıların eklenmesini unutmayın. Ev yapımı mikroakışkan akış sisteminin her bir infusing kapiller ucunu süper flangeless somunu, FEP kılıfı ve süper flangeless ferrule kullanarak her 3-2 valfin üst portuna takın (Şekil 2B). 3-2 valfin (alt bağlantı noktası) kalan açılan bağlantı noktasına, süper flangeless somunu, FEP kılıfı ve süper flangeless ferrule kullanarak 10 cm 450 μm i.d. kılcal damar ı takın (Şekil 2B). Bu kılcal damarlar geri çekilen örnek kılcal damarlar haline gelir. Pompa akışını başlatın ve mikroakışkan akış sisteminin tüm bağlantılarını görsel sızıntılar için kontrol edin. Deneysel akış hızını kullanarak en az üç şırınga hacmi akışı. Son akış hızı lazer ışınlama penceresine, lazer frekansına ve sıfır dışlama fraksiyonhacmine bağlıdır.NOT: Bu protokol için 2,55 mm, 250 μm i.d. erimiş silika, sıfır dışlama fraksiyonu ve 50 Hz frekanslı lazer ışınlama penceresinden 375,52 μL/dk nihai akış hızı hesaplanmıştır. Akış yolu 3-2 valf sapındaki oklarla işaretlenir. Her şırınga, valf kolunun sınır dışı konumundan geri çekilme pozisyonuna taşınması yla manuel olarak doldurulabilir.NOT: 3-2 valftaki sızıntılar süper flangeless somunu yeniden vidalayarak veya vana bağlantılarından herhangi birinin (süper flangeless somunu, FEP kılıfı veya süper flangeless ferrule) değiştirilmesiyle düzeltilebilir. Karıştırma-T’deki sızıntılar mikroakışkan akış sisteminin yeniden bir araya alınmasını gerektirir (2.1-2.11. adımlar). Mikroakışkan akış sistemini deneysel tezgaha taşıyın ve 360 μm paslanmaz çelik birliğini kullanarak çıkış kılcal damarını yayılan aşamaya sabitle(Şekil 2C,D). Uzun menzilli bir çakmak kullanarak, lazer ışınlama penceresinde erimiş silika nın kaplamasını yakın. Yanmış kaplamayı tüy bırakmayan doku ve metanol kullanarak temizleyin.NOT: Aşırı ısı eriyebileceği ve/veya kılcal damarı kırabileceğinden kapillerin aşırı ısınmasını önlemek için yanma döngüleri ve metanol temizleme döngüleri arasında geçiş yapabilirsiniz. Manyetik karıştırıcı bloğunu manyetik karıştırıcıları içeren 5 mL şırınganın üzerine yerleştirin. Manyetik karıştırıcı bloğunun hızını ve konumunu, 5 mL şırınganın içindeki manyetik karıştırıcıların yavaş ve sürekli dönmesini sağlayacak şekilde ayarlayın. 4. In vivo FPOP KrF excimer lazerini açın ve thyratron’un ısınmasını bekleyin.DİkKAT: Lazer, gözlere zarar verebilecek 248 nm dalga boyunda görünür ve görünmez radyasyon yayar. Lazeri açıp ışın çıkış penceresini açmadan önce uygun göz koruması takılmalıdır. Lazer enerjisini en az 100 darbe için 50 Hz frekansta, optik sensörü ışın çıkış penceresine yerleştirerek ölçün.NOT: Bu protokol için 150 ± 2,32 mJ lazer enerjisi ile 2.55 mm ışınlama penceresi kullanılmıştır. Yaklaşık 10.000 solucan (500 μL) edinin ve numuneyi numune şırıngasına el ile çekin. 3 mL’lik son numune hacmi için numune şırıngasını 2,5 mL M9 tamponuyla doldurun. Numune şırıngasına hava kabarcıkları girmediğinden emin olun. İkinci şırıngayı 3 mL 200 mM H2O2ile doldurun , yine şırıngaya hava kabarcıkları girmemesini sağlar. Çıkış kılcal damarının sonunda, 40 mM N’-Dimethylthiourea (DMTU), 40 mM N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) içeren alüminyum folyoya sarılmış 15 mL konik tüp ve h2 O2,hidroksil radikalleri ve methionin süloksit redüktaz aktivitesini söndürmek için %1 dimetil sülfoksit yerleştirin. Excimer lazerini yazılım penceresinden başlatın, ilk darbeyi bekleyin ve çift şırıngadan örnek akışını başlatın.NOT: Numuneler 3 örnek altında teknik trikifler halinde biyolojik tekrarlar halinde çalıştırılmalıdır: H2O2 (örnek) ile lazer ışınlama, H2O2 ile lazer ışınlama ve hiçbir lazer ışınlama h2O2 (kontroller), biyolojik set başına 9 örnek toplam. Numune şırıngasından gelen bazı geri basınç bazen birikebileceğinden, numunenin tamamını 15 mL tüpte toplayın ve herhangi bir görsel sızıntı için numune akışını aktif olarak izleyin. IV-FPOP’tan sonra, 2 dk için 805 x g santrifüjlü pelet solucanları söndürme solüsyonu çözeltisini çıkarın, 250 μL lysis tamponu ekleyin (8 M üre, %0.5 SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM fenilmetilülfonil florür [PMSF]) ekleyin. Numuneyi temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, flaş dondurun ve numune sindirimi kadar -80 °C’de saklayın. 5. Protein ekstraksiyonu, saflaştırma ve proteozis Buzüzerinde dondurulmuş örnekleri eritmek ve 10 s için sonication tarafından homojenize, 60 s buz kuluçka takip. Birden fazla sonication tur gerekli olabilir, homojen bir stereomikroskop altında bir mikroskop slayt üzerinde 2 μL örnek aliquot yerleştirerek görülebilir. Küçük ve hiç solucan parçası görülmediğinde örnek homojenizasyon tamamlanır. 4 °C’de 5 dakika 400 x g’de homojenize solucanları santrifüj edin ve süpernatantı temiz bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Üreticinin talimatlarını kullanarak bicinchoninic asit testini (BCA tsay) kullanarak örnek protein konsantrasyonlarını belirleyin.NOT: Numune konsantrasyonu herhangi bir biyokimyasal protein konsantrasyonu sonucu seçilebilir. Lysis tamponu ile reaktif uyumluluğunu unutmayın (8 M üre, %0.5 SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF). Ayrıca, bir tampon seyreltme gerekli olabilir. Her numuneden 100 μg protein alın ve temiz mikrosantrifüj tüplere yerleştirin. Tüm numunelerde disülfür bağlarını azaltmak için 10 mM’lik son konsantrasyona dithiothreitol (DTT) ekleyin. Girdap, aşağı spin ve 45 dakika boyunca 50 °C’de inkübasyon örnekleri. Numuneleri 10 dk oda sıcaklığına kadar soğutun. Azaltılmış kalıntıları alkillemek için 50 mM’lik son konsantrasyona iodoacetamide (IAA) ekleyin. Vorteks, aşağı spin ve ışıktan korunan oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübasyon örnekleri. Alkililasyondan hemen sonra, protein örneğini 4 cilt önceden soğutulmuş aseton ekleyerek çökün ve gece boyunca -20 °C’de kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, pelet protein10 dakika için 16.000 x g santrifüj tarafından çökelti. Protein peletini 25 mM Tris-HCl (1 μg/μL) olarak yeniden askıya alın. 1:50 (w/w) protein oranına son bir proteazda tripsin ekleyin ve numuneleri bir gecede 37 °C’de sindirin. Ertesi gün% 5 formik asit ekleyerek tripsin sindirim reaksiyonu söndürmek.NOT: LC-MS/MS analizi için numune başına en az 0,5 μg peptid gereklidir (6.1-6.5 adım). Üreticiprotokolünde açıklandığı gibi nicel kolorimetrik peptit testini (Malzemeler Tablosunabakın) kullanarak örnek peptid konsantrasyonlarını belirleyin. 6. Yüksek performanslı sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) Aşağıdaki LC mobil fazlarını kullanın: %0,1 FA (A) ve %0,1 FA (B) ile ACN’de su. C18 (5 μm, 100 Å) içeren bir tuzak kolonuna 0,5 g peptid yükleyin ve 15 μL/dk akış hızında 15 dakika için çözücü A ve %1 B ile yıkama numunesi alın. C18 ters faz malzemesine (5 μm, 125 Å) sahip şirket içi paketlenmiş kolonu (0,075 mm i.d. × 20 mm) kullanan ayrı peptidler. Aşağıdaki analitik ayırma yöntemini kullanın: degrade 120 dk için 300 nL/dk pompalandı: 0−1 dk, %3 B; 2−90 dk, −45 B; 100−105 dk, 0 B; 106−120 dk, %3 B. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi kullanarak pozitif iyon modunda nano-elektrosprey iyonizasyonunda (nESS) peptidlerin veri edinimi gerçekleştirin.NOT: Bu protokol için yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi için ultra performanslı lc (UPLC) alet çift kullanılmıştır. Veri bağımlı toplama kullanılmıştır. MS1 için m/z tararma aralığı 60.000 çözünürlükte 3750-1500 ve 60 s dinamik dışlama idi. +1 ve >6 şarj durumlarına sahip iyonlar hariç tutuldu. Maksimum enjeksiyon süresi 50 ms ve yoğunluk eşiği 5.5e4 olan otomatik kazanç kontrolü (AGC) hedefi kullanıldı. MS2 için seçilen iyonlar % 32 normalleştirilmiş çarpışma enerjisi kullanılarak yüksek enerjili çarpışma dissosiyaasyonuna (HCD) parçalanmaya maruz kaldı. Spektrometrede 15.000 çözünürlüğe ve 5.0e4 AGC hedefine sahip parça iyonları tespit edildi. 7. Veri analizi C. elegans veritabanına karşı aşağıdan yukarıya proteomik analiz yazılımı ile tandem MS dosyalarını arayın. Protein analizi arama parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: bir tripsin cevapsız dekolte, 375-1500 m/z peptit kütle aralığı, 0,02 parça kütle toleransı ve 10 ppm öncül kütle toleransı. Karbamidomethylation statik bir modifikasyon olarak ayarlanır ve tüm hidroksil radikal yan zincir modifikasyonları biliyorum9,10 dinamik olarak. Peptit tanımlama% 95 güven (orta) ve kalıntı% 99 güven (yüksek) olarak kurulmuştur. Yanlış bulma oranı (FDR) %1 olarak ayarlanır. Verileri elektronik bir veritabanına aktarın ve11’inaltındaki denklemi kullanarak peptid veya kalıntı başına oksidasyonun kapsamını özetleyin:NOT: EIC alanının modifiye edildiği yerde, oksidatif modifikasyon ile peptid veya kalıntının çıkarılan iyon kromatografik alanı (EIC) ve EIC alanı oksidatif modifikasyon ile aynı peptid veya kalıntının toplam alanıdır.