イン・ビボヒドロキシルラジカルプロテインフットプリントにおけるカエノハブディティス・エレガンスにおけるタンパク質相互作用の研究

1. C. エレガンスのメンテナンスと文化 ワームコロニーを成長させ、標準的な実験室の手順8に従って第4の幼虫(L4)段階に同期させる。 IV-FPOP実験の日は、細菌の芝生からL4ワームを洗浄 (OP50大腸菌) M9バッファ (0.02 M KH2PO4,0.08 M Na2HPO4,0.08 M NaCl, 1 mM MgSO4). IV-FPOPサンプルあたり〜10,000のワームの500 μLのアリコートを得る。 2. マイクロ流体流動システムアセンブリ 2 cmのフッ素エチレンプロピレン(FEP)チューブ(1/16インチ外径(o.d.)x 0.020 インチ内径(i.d.))を切断して、流動システムアセンブリを開始します。 きれいな解剖針を使用して、片端のみの小さなクレーターを作るためにFEP管のi.d.を広げ、長さは50mm〜50mmです。クレーターは、2つの360 μm o.d.の融合シリカ片に収まるのに十分な大きさでなければなりません。注: この端点は出口の毛細管に合うためにだけ使用されるので、反対側の端を広げないでください。 セラミックカッターで、250 μm i.d. の 15 cm の 2 つの部分を切断し、シリカを融合させます。これら2つの部分は、フローシステムの注入ラインになります。 自己接着テープを使用して、2つの250 μm i.d.毛細血管をテープでつなぎ合わせて、互いに平行であり、その端部が100%フラッシュされていることを確認します。注:切断後に融合したシリカの端が破砕されないように、まっすぐで100%互いに洗い流されるようにするには、虫眼鏡またはステレオ顕微鏡を使用して調べることをお勧めします。 2 つのテーピングされた毛細血管を FEP チューブの手作りのクレーターに挿入します。手作りのクレーターの端まで毛細血管を押し上げます。注意:フローシステムの有効性を維持するために、手作りのクレーターを通り過ぎないでください(図1a)。 きれいな表面にエポキシ樹脂の小さなドットを置き、解剖針と混合します。 素早く、同じ針を使用して、FEPチューブと接続する注入毛細血管の端に少量の樹脂を置き、樹脂を乾燥させ、出口側を吊り下げ、数分間(図1a)。 樹脂が乾燥している間、FEPチューブと2つの毛細血管を結合させ、新しい250 μm i.d.毛細血管を切断します。新しい毛細管は流れシステムの出口毛細管になる。毛細管の所望の長さは、以下の式を使用して計算することができます。ここでlはセンチメートルで切断される毛細管の長さ、tは分単位での所望の反応時間、fはmL/minの流量、すなわちセンチメートルの毛細管の内径である。注:出口毛細管を切断した後、端部を調べて、まっすぐで破砕していないことを確認します。 樹脂が乾燥したら、新しいキャピラリーをFEPチューブ出口の端に差し込みます。出口毛細管の内側の端と2つの注入毛細管は、FEPチューブ内で互いにフラッシュする必要があり、これは混合Tを作成する(図1b)。 ステップ2.6および2.7に記載されているように、出口毛細管およびFEPチューブを新鮮なエポキシ樹脂と結合する。 樹脂がフローシステムを一緒に一晩乾燥させます。翌日マイクロ流体流量システムをセットアップします(図1c)。 3. 生体内FPOP用マイクロ流体流動システム 1つの5 mLシリンジの中に4つの磁気スターラーを挿入します。この注射器はサンプルシリンジになります。磁気スターラーは、IV-FPOP(図2A)中に、ワームが注射器の内側に落ち着くのを防ぎます。 2本の5mLシリンジをM9で満たします。流量や混合効率に影響を与える可能性があるため、各シリンジ内に気泡がないことを確認してください。 Luer アダプタを各 5 mL シリンジに接続して、指がしっかりと固定されていることを確認します。 各シリンジを1つの3-2バルブに取り付けます。シリンジは、バルブの中央ポートに取り付ける必要があります(図2B)。 各5 mLのシリンジをデュアルシリンジポンプに固定し、プッシャーブロックからのシリンジへの過圧を防ぐために、メカニカルストップカラーを調整します。ストップカラーを設定する際には、磁気スターラーの追加を心に留めておいてください。 スーパーフランヘレスナット、FEPスリーブ、スーパーフランヘラミフェルールを使用して、自家製マイクロ流体流動システムの各注入毛細管端を各3-2バルブの上のポートに取り付けます(図2B)。 3-2バルブ(ボトムポート)の残りの開いたポートに、スーパーフランジェルナット、FEPスリーブ、スーパーフランヘラミを使用して10cm 450 μm i.d.キャピラリーを取り付けます(図2B)。これらの毛細血管は、採取サンプル毛細血管になります。 ポンプフローを開始し、マイクロ流体フローシステムのすべての接続を確認して、視覚的な漏れがないか確認します。実験流量を用いて少なくとも3つのシリンジボリュームを流す。最終流量は、レーザー照射窓、レーザー周波数、ゼロ排除分量量に依存します。注:このプロトコルでは、2.55mm、250 μm i.d.融合シリカ、ゼロ排除分率、50Hz周波数のレーザー照射窓から375.52 μL/minの最終流量を計算しました。 流路は3-2バルブハンドルの矢印でマークされます。各シリンジは、バルブハンドルを排出位置から引き出し位置に移動することで、手動で補充することができます。注:3-2バルブの漏れを修正するには、スーパーフランヘレスナットを再ねじ込むか、バルブ接続(スーパーフランダースナット、FEPスリーブ、またはスーパーフランジェルスフェルール)を交換します。混合Tでのリークは、マイクロ流体流動システムの再組み立てが必要です(ステップ2.1〜2.11)。 マイクロ流体流動システムを実験ベンチに移動し、360 μm o.d. ステンレス鋼の組合を使用して、出口の毛細管を放射段階に固定します(図2C,D)。 長い範囲のライターを使用して、レーザー照射窓に融合シリカのコーティングを燃やします。糸くずのない組織とメタノールを使用して、焼けたコーティングをきれいにしてください。注:過剰な熱が溶融したり、キャピラリーを壊すことができるので、キャピラリーを過熱しないように燃焼サイクルとメタノール洗浄サイクルを交互に行います。 磁気スターラーを含む5 mLシリンジの上に磁気スターラーブロックを配置します。磁気スターラーブロックの速度と位置を調整して、5 mLシリンジ内の磁気スターラーがゆっくりと常に回転するようにします。 4. イン・ビボFPOP KrFエキシマレーザーをオンにし、チラトロンをウォームアップします。注意:レーザーは目を傷つける可能性のある248 nmの波長で目に見える、目に見えない放射を放出する。レーザーをオンにしてビーム出口ウィンドウを開く前に、適切な目の保護を着用する必要があります。 光センサをビーム出口ウィンドウに配置して、少なくとも100パルスの50Hzの周波数でレーザーエネルギーを測定します。注:このプロトコルでは、150 ± 2.32 mJのレーザーエネルギーで2.55mmの照射窓を使用しました。 約10,000個のワーム(500μL)を入手し、サンプルをサンプルシリンジに手動で取り出します。 サンプルシリンジに2.5 mLのM9バッファを充填し、最終的なサンプル容量を3 mLにします。サンプルシリンジに気泡が入らないようにしてください。 200 mM H2O2の 3 mL で 2 番目のシリンジを充填し、再び気泡がシリンジに導入されないようにします。 出口毛細管の終わりに、 40 mM N’-ジメチルチオウラ(DMTU)の6 mLを含むアルミニウム箔で包まれた15mL円錐形チューブを置き、40 mM N-tert-ブチル-α-フェニルニトロン(PBN)、1%ジメチルスルホキシドを余分H2O2、ヒドロキシルラジカル、およびメチオンスルポキシド還元を抑制します。2 ソフトウェアウィンドウからエキシマレーザーを起動し、最初のパルスを待ち、デュアルシリンジからサンプルフローを開始します。注:サンプルは、3つの条件下で技術的な三重で生物学的複製で実行する必要があります:H2O2(サンプル)によるレーザー照射、H2O2によるレーザー照射なし、レーザー照射なしH2O2(コントロール)、生物学的セットあたり9サンプルに合計。 サンプル全体を15 mLチューブに集め、サンプルシリンジからの背圧が時々蓄積する可能性があるため、視覚的な漏れがないかサンプルフローを積極的に監視します。 IV-FPOPに続いて、805 x gで2分間遠心分離することによりペレットワームを除去し、250μLの溶解緩衝液(8M尿素、0.5%SDS、50 mM HEPES、50 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EDTA、1 mMフェニルメチルスルホロンフッ化物[PMSF])を加える。サンプルをきれいなマイクロ遠心チューブに移し、フラッシュフリーズし、サンプル消化まで-80 °Cで保存します。 5. タンパク質の抽出、精製、タンパク質分解 氷上の凍結サンプルを解凍し、10 sの超音波処理によって均質化し、続いて60 sの氷のインキュベーションを行う。超音波処理の複数のラウンドが必要とされ得、ホモジネートは、顕微鏡スライド上に2μLサンプルアリコートを置くことによって実体顕微鏡下で観察することができる。小さなワームが見られない場合、サンプルの均質化は完了します。 遠心分離機は4°Cで5分間400 x gでホモゲン化されたワームを、きれいなマイクロ遠心分離管に上清を集める。 メーカーの指示書を使用して、バイチンチオン酸アッセイ(BCAアッセイ)を使用してサンプルタンパク質濃度を決定します。注:サンプル濃度は、任意の生化学的タンパク質濃度アッセイを使用して決定することができます。リシスバッファー(8 M尿素、0.5%SDS、50 mM HEPES、50 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM PMSF)との試薬の相溶性に留意してください。さらに、バッファー希釈が必要な場合があります。 各サンプルから100μgのタンパク質を得て、きれいなマイクロ遠心チューブに入れる。 ジチオスレイトール(DTT)を10 mMの最終濃度に加え、すべてのサンプル中のジスルフィド結合を低減します。渦、スピンダウン、50°Cでサンプルを45分間インキュベートします。 10分間室温までサンプルを冷却します。 50 mM最終濃度にヨウオアセトアセトアミド(IAA)を加える。渦、スピンダウン、および光から保護された室温で20分間のサンプルをインキュベートします。 アルキル化の直後に、100%前冷やしたアセトンを4分の4量加えてタンパク質サンプルを沈殿させ、-20°Cで一晩インキュベートする。 翌日、ペレットタンパク質は16,000 x gで10分間遠心分離して沈殿し、90%アセトンでサンプルペレットを洗浄し、上清を除去し、ペレットを2〜3分間乾燥させます。 タンパク質ペレットを25 mM Tris-HCl(1 μg/μL)に再び懸濁します。1:50(w/w)のタンパク質比に対する最終的なプロテアーゼでトリプシンを加え、一晩で37 °Cでサンプルを消化します。 翌日、5%のギ酸を加えてトリプシン消化反応を消す。注:LC-MS/MS分析には、サンプルあたり最小0.5μgのペプチドが必要です(ステップ6.1~6.5)。定量的な着色ペプチドアッセイ(材料表参照)を使用してサンプルペプチド濃度を決定します( 6. 高速液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS) 0.1% FA (A) の水と 0.1% FA (B) の ACN の LC 移動相を使用します。 0.5 μgのペプチドを C18 (5 μm, 100 Å) を含むトラップカラム (180 μm × 20 mm) に積み込み、サンプルを 99% の溶媒 A と 1% B で 15 μL/min の流量で 15 分間洗浄します。 C18逆相材料(5 μm、125 Å)を用いた社内パックカラム(0.075 mm i.d.×20 mm)を用いた別々のペプチド。 次の分析分離方法を使用して、勾配を 300 nL/min で 120 分間に送り出しました: 0-1 分、3% B;2-90分、10-45%B;100-105分、100%B;106-120分、3%B 高分解能質量分析計を用いて、ポジティブイオンモードナノエレクトロスプレーイオン化(nESI)でペプチドのデータ取得を行います。注:このプロトコルでは、高解像度の質量分析計に対する超高性能LC(UPLC)機器の組み合わしが利用されました。データ依存的な取得を利用した。MS1 の m/z スキャン範囲は、60,000 解像度で 3750 ~ 1500、動的除外 60 個でした。+1 および >6 の電荷状態のイオンは除外されました。5.5e5の自動ゲイン制御(AGC)ターゲットを使用し、最大射出時間は50 ms、強度しきい値は5.5e4でした。MS2用に選択されたイオンは、32%正規化された衝突エネルギーを用いて、より高エネルギーの衝突解離(HCD)断片化を行った。15,000分解能と5.0e4 AGCターゲットを用いて分光計でフラグメントイオンを検出した。 7. データ分析 C.エレガンスデータベースに対するボトムアッププロテオミクス分析ソフトウェアを使用してタンデムMSファイルを検索します。 タンパク質分析の検索パラメータを次のように設定します: 1 トリプシンは切断を逃した、375-1500 m/zペプチド質量範囲、0.02のフラグメント質量許容範囲、前駆体質量許容値は10 ppmです。カルバミドメチル化は、静的修飾として設定され、全てヒドロキシルラジカル側鎖修飾9,1010を動的として知っている。ペプチド同定は、95%の信頼度(中)および残基で99%の信頼度(高)で確立される。誤検出率 (FDR) は 1% に設定されます。 電子データベースにデータをエクスポートし、以下の式を使用してペプチドまたは残留物あたりの酸化の程度を要約します11:注:EIC領域が酸化修飾を伴うペプチドまたは残基の抽出されたイオンクロマトグラフィー領域(EIC)であり、EIC領域は酸化修飾の有無にかかわらず同じペプチドまたは残基の総面積である。