In vivo hurtig fotokemisk oxidation af proteiner (IV-FPOP) er en hydroxyl radikal protein fodspor teknik, der giver mulighed for kortlægning af proteinstruktur i deres oprindelige miljø. Denne protokol beskriver samling og opsætning af IV-FPOP mikrofluidic flow system.
Hurtig oxidation af proteiner (FPOP) er en hydroxylradikal proteinfootprinting (HRPF) metode, der anvendes til at studere proteinstruktur, protein-ligand interaktioner, og protein-protein interaktioner. FPOP anvender en KrF excimer laser ved 248 nm for fotolyse af hydrogenperoxid til at generere hydroxyl radikaler, som igen oxidativt ændre opløsningsmiddel-tilgængelige aminosyre sidekæder. For nylig har vi udvidet brugen af FPOP af in vivo oxidative mærkning i Caenorhabditis elegans (C. elegans), med titlen IV-FPOP. De gennemsigtige nematoder er blevet brugt som modelsystemer for mange sygdomme hos mennesker. Strukturelle undersøgelser i C. elegans af IV-FPOP er mulige på grund af dyrets evne til at tilføre hydrogenperoxid, deres gennemsigtighed over for laserbestråling ved 248 nm og ændringens uigenkaldelige karakter. Samling af et mikrofluidisk flowsystem til IV-FPOP-mærkning, IV-FPOP-parametre, proteinekstraktion og LC-MS/MS-optimerede parametre er beskrevet heri.
Proteinfodaftryk kombineret med massespektrometri (MS) er blevet brugt i de senere år til at studere proteininteraktioner og kropsbygningsændringer. Hydroxyl radikalprotein fodaftryk (HRPF) metoder sonde protein solvent tilgængelighed ved at ændre protein aminosyre sidekæder. HRPF-metoden, hurtig fotokemisk oxidation af proteiner (FPOP)1, er blevet anvendt til at sonde proteinstruktur in vitro2, in-cell (IC-FPOP)3, og senest in vivo (IV-FPOP)4. FPOP udnytter en 248 nm bølgelængde excimer laser for hurtigt at generere hydroxyl radikaler ved fotolyse af hydrogenperoxid til at danne hydroxyl radikaler1. Til gengæld kan disse radikaler mærke 19 ud af 20 aminosyrer på en mikrosekund tidsskala, hurtigere end proteiner kan udfolde sig. Selv om reaktiviteten af hver aminosyre med hydroxylradikaler strækker sig 1000 gange, er det muligt at normalisere sidekædeoxidation ved at beregne en beskyttelsesfaktor (PF)5.
Da FPOP oxidativt kan ændre proteiner uanset deres størrelse eller primære sekvens, viser det sig at være fordelagtigt for in-cell og in vivo protein undersøgelser. IV-FPOP-sondernes proteinstruktur i C. elegans på samme måde som in vitro- og incellestudier4. C. elegans er en del af nematode familien og er meget udbredt som en model til at studere sygdomme hos mennesker. Ormens evne til at optage brintoverilte ved både passiv og aktiv diffusion giver mulighed for undersøgelse af proteinstruktur i forskellige kropssystemer. Desuden er C. elegans velegnet til IV-FPOP på grund af deres gennemsigtighed ved den 248 nm laserbølgelængde, der er nødvendig for FPOP6. Kobling af denne metode til massespektrometri giver mulighed for identifikation af flere modificerede proteiner ved hjælp af traditionelle bottom-up proteomics tilgange.
I denne protokol beskriver vi, hvordan man udfører IV-FPOP til analyse af proteinstruktur i C. elegans. Forsøgsprotokollen kræver samling og opsætning af mikrofluidisk flowsystem til IV-FPOP tilpasset fra Konermann et al7. Efter IV-FPOP homogeniseres prøverne til proteinekstraktion. Proteinprøver proteolyseres, og peptider analyseres ved flydende kromatograf (LC) tandem MS, efterfulgt af kvantificering.
Det nuværende benchmark for undersøgelse af in vivo protein-protein interaktioner (PPI) er fluorescens resonans energioverførsel (FRET). I sin mest enkle form, denne teknik undersøgelser PPI ved energioverførsel mellem to molekyler, når de er i nærheden af hinanden15. I modsætning til MS teknikker, fret ikke har den beslutning at karakterisere konformationelle ændringer og interaktion steder på aminosyre niveau. Ms-baserede teknikker er i stigende grad blevet anvendt til studiet af PPI16. IV-FPOP er en HRPF-metode, der giver mulighed for in vivo protein strukturel analyse i C. elegans. For at kunne mærke C. elegans med IV-FPOP er det vigtigt at samle det mikrofluidiske flowsystem korrekt for at reducere prøvetabet. Kapillær på 250 μm i.d har vist sig at maksimere prøvegenvindingsammenlignet med mindre id-kapillærer4. Større id kapillærer er ikke blevet testet, men mikrofluidic flow system er designet ved hjælp af en kapillær med samme id som en kommercielt tilgængelige flow cytometri system til sortering af C. elegans. 17 Ormeprøvens størrelse er også vigtig, at en stikprøvestørrelse på mindre end ~10.000 pr. prøve før FPOP ikke giver proteinkoncentrationer, der er høje nok til LC-MS/MS-analyse. Højere prøvestørrelser (>10.000 orme) kan også bruges ved at justere den oprindelige startmængde (trin 4.5).
Korrekt samling af det mikrofluidiske flowsystem er vigtig. Utætheder i prøvevejen resulterer i en inkonsekvent strøm af orme eller H2O2. Ferrules, ærmer og 3-2 ventiler kan genbruges fra flere IV-FPOP eksperimenter, hvis korrekt rengjort efter hvert eksperiment. Vi anbefaler dog at samle et nyt mikrofluidisk flowsystem til hver biologisk replikat. Hvis mikrofluidics er korrekt samlet, ormene og H2O2 vil blande på blanding-T med minimalt modtryk. Som kvalitetskontrol (QC) af mikrofluidisk flowsystem anbefaler vi, at du tester blandingseffektiviteten ved hjælp af farvede farvestoffer. Det er vigtigt at overvåge bevægelsen af de magnetiske omrørere inde i ormen sprøjten under IV-FPOP, forkert prøve blanding på ormen sprøjten eller blanding-T kan resultere i modtryk forårsager lækager. Desuden fører dårlige blandingsforhold til store prøvetab, dårlig lasereksponering af orme ved laservinduet og tilstopning.
C. elegans vedligeholdelse er vigtig for at mindske baggrundsoxidation. Vi anbefaler, at ormene vokser ved lave temperaturer under lave stressforhold, da høje temperaturer kan påvirke den samlede baggrundsoxidation. Et kontrolprøvesæt af orme, ingen H2O2 og ingen laserbestråling, anbefales til alle IV-FPOP-forsøg for at tage højde for baggrundsoxidation på grund af laboratorievedligeholdelse. En af de nuværende begrænsninger af denne teknik er det samlede antal oxidativt modificerede peptider identificeret og det samlede antal rester oxideret pr peptid for at få højere protein strukturelle oplysninger. Selv om det ikke anbefales, en stigning i oxidative ændringer kunne opnås ved hjælp af højere koncentrationer af hydrogenperoxid. En stigning i hydrogenperoxid kan i væsentlig grad ændre vigtige biologiske veje samt føre til oxidation-induceret udfoldelse. Hvis hydrogenperoxidkoncentrationen for IV-FPOP øges, anbefales det at teste ormens levedygtighed og baggrundsoxidation, da koncentrationer på over 200 mM ikke er blevet testet.
Den beskrevne LC-MS/MS-protokol kan optimeres og ændres, så den opfylder MS QC fra andre laboratorier. Brugen af 2D-kromatografi teknikker har tidligere vist sig at øge identifikationen af oxidativt modificerede peptider og proteiner18. Ikke desto mindre anbefales proteinberigelsesteknikker, der er målrettet mod et bestemt protein af interesse, ikke, herunder, men ikke begrænset til, antistofudfældning eller pull-down-analyser. Disse teknikker kan skævheder i retning af en protein conformer, hvis epitop / bindende sted for proteinet er blevet oxidativt ændret ved IV-FPOP. Nye udviklinger i fodaftryk radikale reagenser, såsom sulfat radikal anion10 eller trifluormethylering19 kunne øge alsidigheden af IV-FPOP. Selv om det eneste mærkningsreagens, der er testet in vivo indtil videre, er brintoverilte, kan andre laseraktiverede radikaler optimeres. Brugen af andre radikaler skulle vise sig at være forenelig med ormen levedygtighed, celle gennemtrængelig, og 248 nm laser bølgelængde. På grund af brugen af C. elegans som modelsystem for mange sygdomme hos mennesker har IV-FPOP potentiale til at have en stærk indvirkning på studiet af proteinstrukturens rolle i sygdomspagenese.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af start-up midler fra University of Maryland, Baltimore og NIH 1R01 GM 127595 tildelt LMJ. Forfatterne takker Dr. Daniel Deredge for hans hjælp til at redigere manuskriptet.
15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
5 mL Gas Tight Syringe, Removable Luer Lock | SGE Analytical Science | 008760 | 2 minimum |
60 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FM3279 | This item is no longer available. Any low-volume sonicator will be sufficient |
Acetone, HPLC Grade | Fisher Scientific | A929-4 | 4 L quantity is not necessary |
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 Trap Column, 100Å, 5 µm, 180 µm x 20 mm, 2G, V/M, 1/pkg | Waters | 186007496 | |
ACQUITY UPLC M-Class System | Waters | ||
Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | any brand is sufficient |
Aqua 5 µm C18 125 Å packing material | Phenomenex | ||
Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
Dissecting Needle | Fisher Scientific | 50-822-525 | only a couple are needed |
Dithiothreiotol (DTT) | AmericanBio | AB00490-00005 | |
DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
Epoxy instant mix 5 minute | Loctite | 1365868 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-100 | |
EX350 excimer laser (248 nm wavelength) | GAM Laser | ||
FEP Tubing 1/16" OD x 0.020" ID | IDEX Health & Sciene | 1548L | |
Formic Acid, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
HV3-2 VALVE | Hamilton | 86728 | 2 minimum |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
Iodoacetamide (IAA) | ACROS Organics | 122270050 | |
Legato 101 syringe pump | KD Scientific | 788101 | |
Luer Adapter Female Luer to 1/4-28 Male Polypropylene | IDEX Health & Sciene | P-618L | 2 minimum |
Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M65-500 | |
Methanol, LC/MS Grade | Fisher Scientific | A454SK-4 | 4 L quantity is not necessary |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
N,N′-Dimethylthiourea (DMTU) | ACROS Organics | 116891000 | |
NanoTight Sleeve Green 1/16" ID x .0155" ID x1.6"' | IDEX Health & Sciene | F-242X | |
NanoTight Sleeve Yellow 1/16" OD x 0.027" ID x 1.6" | IDEX Health & Sciene | F-246 | |
N-tert-Butyl-α-phenylnitrone (PBN) | ACROS Organics | 177350250 | |
OmniPur Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | 7110-OP | any protease inhibitor is sufficient |
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used | |
PE50-C pyroelectric energy meter | Ophir Optronics | 7Z02936 | |
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | 23275 | |
Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | A53225 | |
Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 250µm, Outer Diameter 350µm, TSP250350 | Polymicro Technologies | 1068150026 | |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 450µm, Outer Diameter 670µm, TSP450670 | Polymicro Technologies | 1068150625 | |
Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 75µm, Outer Diameter 375µm, TSP075375 | Polymicro Technologies | 1068150019 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P382-500 | |
Proteome Discover (bottom-up proteomics software) | Thermo Scientific | OPTON-30799 | |
Rotary Magnetic Tumble Stirrer | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3 | |
Rotary Magnetic Tumble Stirrer, accessory kit for use with Syringe Pumps | V&P Scientific, Inc. | VP 710D3-4 | |
Scissors | Fisher Scientific | 50-111-1315 | any scissors are sufficient |
Self-Adhesive Label Tape | Fisher Scientific | 15937 | one roll is sufficient |
Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes | Fisher Scientific | 05-402 | any brand is sufficient |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | 15-525-017 | |
Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | |
Stereo Zoom Microscope | Fisher Scientific | 03-000-014 | a magnifying glass is sufficient |
Super Flangeless Ferrule w/SST Ring, Tefzel (ETFE), 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" OD | IDEX Health & Sciene | P-259X | |
Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 Flat-Bottom, for 1/16" & 1/32" OD | IDEX Health & Sciene | P-255X | |
Super Tumble Stir Discs, 3.35 mm diameter, 0.61 mm thick | V&P Scientific, Inc. | VP 722F | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
Universal Base Plate, 2.5" x 2.5" x 3/8" | Thorlabs Inc. | UBP2 | |
Urea | Fisher Scientific | U5378 | |
VHP MicroTight Union for 360µm OD | IDEX Health & Sciene | UH-436 | 2 minimum |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |