Summary

Quantitative Analyse des Zelllipidoms von Saccharomyces Cerevisiae mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Published: March 08, 2020
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Summary

Wir präsentieren ein Protokoll mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie, um wichtige zelluläre Lipide in Saccharomyces cerevisiaezu identifizieren und zu quantifizieren. Die beschriebene Methode zur quantitativen Bewertung wichtiger Lipidklassen innerhalb einer Hefezelle ist vielseitig, robust und empfindlich.

Abstract

Lipide sind strukturell vielfältige amphipathische Moleküle, die in Wasser unlöslich sind. Lipide sind wesentliche Beiträge zur Organisation und Funktion biologischer Membranen, Energiespeicherung und -produktion, zelluläre Signalisierung, vesikulärer Transport von Proteinen, Organellebiogenese und regulierter Zelltod. Da die aufkeimende Hefe Saccharomyces cerevisiae ein einzelliges Eukaryoten ist, das für gründliche molekulare Analysen zugänglich ist, half seine Verwendung als Modellorganismus, Mechanismen aufzudecken, die den Fettstoffwechsel mit dem intrazellulären Transport mit komplexen biologischen Prozessen innerhalb eukaryotischer Zellen verbinden. Die Verfügbarkeit einer vielseitigen Analysemethode für die robuste, empfindliche und genaue quantitative Bewertung wichtiger Lipidklassen innerhalb einer Hefezelle ist entscheidend, um tiefe Einblicke in diese Mechanismen zu erhalten. Hier stellen wir ein Protokoll zur Verwendung der Flüssigchromatographie in Verbindung mit der Tandemmassenspektrometrie (LC-MS/MS) für die quantitative Analyse der wichtigsten zellulären Lipide von S. cerevisiae vor. Die beschriebene LC-MS/MS-Methode ist vielseitig und robust. Es ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung zahlreicher Arten (einschließlich verschiedener isobarer oder isomerischer Formen) innerhalb jeder der 10 Lipidklassen. Diese Methode ist empfindlich und ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung einiger Lipidarten in Konzentrationen von bis zu 0,2 pmol/l. Die Methode wurde erfolgreich angewendet, um Lipidome ganzer Hefezellen und ihrer gereinigten Organellen zu bewerten. Der Einsatz alternativer mobiler Phasenadditive für die Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie bei dieser Methode kann die Ionisationseffizienz bei einigen Lipidarten erhöhen und kann daher zur Verbesserung ihrer Identifizierung und Quantifizierung eingesetzt werden.

Introduction

Eine Reihe von Beweisen zeigt, dass Lipide, eine der wichtigsten Klassen von Biomolekülen, spielen wesentliche Rolle in vielen lebenswichtigen Prozessen innerhalb einer eukaryotischen Zelle. Diese Prozesse umfassen die Montage von Lipid-Doppelschichten, die die Plasmamembran und Membranen umgebenden Zellorganellen bilden, den Transport kleiner Moleküle über Zellmembranen, die Reaktion auf Veränderungen in der extrazellulären Umgebung und intrazelluläre Signaltransduktion, die Erzeugung und Speicherung von Energie, den Import und Export von Proteinen, die auf verschiedene Organellen beschränkt sind, vesikulären Handel mit Proteinen innerhalb des Endomembransystems und der Proteinsekretion sowie verschiedene Arten des regulierten Zelltodes1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.

Die angehende Hefe S. cerevisiae, ein einzelliger eukaryotischer Organismus, wurde erfolgreich verwendet, um einige der Mechanismen zu entdecken, die den wesentlichen Rollen von Lipiden in diesen lebenswichtigen zellulären Prozessen zugrundeliegen 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae ist ein wertvoller Modellorganismus für die Aufdeckung dieser Mechanismen, weil er für umfassende biochemische, genetische, zellbiologische, chemische, biologische, systembiologische und mikrofluidische Dissektionsanalysen21,22,23,24,25zugänglich ist. Weitere Fortschritte beim Verständnis von Mechanismen, durch die der Fettstoffwechsel und der intrazelluläre Transport zu diesen lebenswichtigen zellulären Prozessen beitragen, erfordern empfindliche Massenspektrometrietechnologien für die quantitative Charakterisierung des zellulären Lipidoms, das Verständnis der molekularen Lipidkomplexität und die Integration der quantitativen Lipidomik in eine multidisziplinäre Plattform der Systembiologie1,2,3,26, 27,28,29,30.

Aktuelle Methoden für die Massenspektrometrie-unterstützte quantitative Lipidomik von Hefezellen und Zellen anderer eukaryotischer Organismen sind nicht ausreichend vielseitig, robust oder empfindlich. Darüber hinaus sind diese derzeit verwendeten Methoden nicht in der Lage, verschiedene isobarische oder isomerische Lipidarten voneinander zu unterscheiden. Hier beschreiben wir eine vielseitige, robuste und empfindliche Methode, die den Einsatz von Flüssigchromatographie in Verbindung mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) für die quantitative Analyse der wichtigsten zellulären Lipide von S. cerevisiaeermöglicht.

Protocol

1. Herstellung steriler Medien zur Hefekultierung Bereiten Sie 90 ml eines vollständigen YP-Mediums vor, das 1% (w/v) Hefeextrakt und 2% (w/v) Bactopepton enthält. Bereiten Sie 90 ml eines synthetischen minimalen YNB-Mediums vor, das 0,67 % (w/v) Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren, 20 mg/L L-Histidin, 30 mg/L L-Leucin,30 mg/L L-Lysinund 20 mg/L Uracil enthält. 90 ml des gesamten YP-Mediums gleichmäßig in zwei 250 ml Erlenmeyerkolben (d.h. je 45 ml) aufteil…

Representative Results

Unsere Methode zur quantitativen Bewertung wichtiger zellulärer Lipide innerhalb einer Hefezelle mit Hilfe von LC-MS/MS war vielseitig und robust. Es ermöglichte uns, 10 verschiedene Lipidklassen in S. cerevisiae Zellen zu identifizieren und zu quantifizieren, die im synthetischen minimalen YNB-Medium kultiviert wurden, das zunächst 2% Glukose enthielt. Diese Lipidklassen umfassen freie (unesterifizierte) Fettsäuren (FFA), CL, Phytoceramid (PHC), Phytosphingosin (PHS), PC, PE…

Discussion

Die folgenden Vorsichtsmaßnahmen sind wichtig für die erfolgreiche Implementierung des hier beschriebenen Protokolls:

1. Chloroform und Methanol sind giftig. Sie extrahieren effizient verschiedene Substanzen von Oberflächen, einschließlich Labor-Kunststoffundzeug und Ihre Haut. Behandeln Sie daher diese organischen Lösungsmittel mit Vorsicht, indem Sie die Verwendung von Kunststoffen in Schritten vermeiden, die den Kontakt mit Chloroform und/oder Methanol beinhalten, Borosilikatglaspipett…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Titorenko-Labors für Diskussionen. Wir würdigen das Zentrum für biologische Anwendungen der Massenspektrometrie und das Zentrum für Strukturelle und Funktionelle Genomik (beide an der Concordia University) für herausragende Leistungen. Diese Studie wurde durch Stipendien des Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) kanadas (RGPIN 2014-04482) und des Concordia University Chair Fund (CC0113) unterstützt. K.M. wurde vom Concordia University Merit Award unterstützt.

Materials

15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps PYREX 05-550
2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps Fisher Scientific 60180A-SV9-1P
2-Propanol Fisher Scientific A461-500
Acetonitrile Fisher Scientific A9554
Agilent 1100 series LC system Agilent Technologies G1312A
Agilent1100 Wellplate Agilent Technologies G1367A
Ammonium acetate Fisher Scientific A11450
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Ammonium formate Fisher Scientific A11550
Ammonium hydroxide Fisher Scientific A470-250
Bactopeptone Fisher Scientific BP1420-2
Cardiolipin Avanti Polar Lipids 750332
Centra CL2 clinical centrifuge Thermo Scientific 004260F
Ceramide Avanti Polar Lipids 860517
Chloroform Fisher Scientific C297-4
CSH C18 VanGuard Waters 186006944 Pre-column system
Free fatty acid (19:0) Matreya 1028
Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) Sigma-Aldrich G8772
Glucose Fisher Scientific D16-10
Hemacytometer Fisher Scientific 267110
L-histidine Sigma H8125
Lipid Search software (V4.1) Fisher Scientific V4.1 LC-MS/MS analysis software
L-leucine Sigma L8912
L-lysine Sigma L5501
Methanol Fisher Scientific A4564
Phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 850340
Phosphatidylethanolamine Avanti Polar Lipids 850704
Phosphatidylglycerol Avanti Polar Lipids 840446
Phosphatidylinositol Avanti Polar Lipids LM1502
Phosphatidylserine Avanti Polar Lipids 840028
Reverse-phase column CSH C18 Waters 186006102
Sphingosine Avanti Polar Lipids 860669
Thermo Orbitrap Velos MS Fisher Scientific ETD-10600
Tricylglycerol Larodan, Malmo TAG Mixed FA
Ultrasonic sonicator Fisher Scientific 15337416
Uracil Sigma U0750
Vortex Fisher Scientific 2215365
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Yeast nitrogen base without amino acids Fisher Scientific DF0919-15-3
Yeast strain BY4742 Dharmacon YSC1049

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Mohammad, K., Jiang, H., Hossain, M. I., Titorenko, V. I. Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (157), e60616, doi:10.3791/60616 (2020).

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