Summary

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッカロミセス・セレビシエ細胞リピドームの定量的解析

Published: March 08, 2020
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Summary

サッカロミセス・セレビシエの主要な細胞脂質を同定し定量するために、タンデム質量分析と相まって液体クロマトグラフィーを用いたプロトコルを提示する。酵母細胞内の主要な脂質クラスの定量的評価のための記載された方法は、汎用性、堅牢、および感受性である。

Abstract

脂質は、水に不溶性の構造的に多様な両型分子です。脂質は、生体膜の組織と機能、エネルギー貯蔵および生産、細胞シグナル伝達、タンパク質の静脈輸送、オルガネラ生物新生、および調節された細胞死に不可欠な貢献者です。出芽酵母サッカロミセス・セレビシエは、分子解析を徹底するのに適した単細胞真核生物であるため、モデル生物としての使用は、脂質代謝と細胞内輸送を真核細胞内の複雑な生物学的プロセスに結びつけるメカニズムを明らかにするのに役立った。酵母細胞内の主要な脂質クラスの堅牢で敏感で正確な定量的評価のための汎用性の高い分析方法の利用は、これらのメカニズムに関する深い洞察を得るために重要です。ここでは、S.cerevisiaeの主要な細胞脂質の定量分析のために、タンデム質量分析(LC-MS/MS)と相まって液体クロマトグラフィーを使用するプロトコルを提示する。記載されているLC-MS/MS法は、汎用性が高く、堅牢です。10種類の脂質クラスの中で、多数の種(異なる同種または異性体を含む)の同定と定量が可能です。この方法は感度が高く、0.2 pmol/μLの低濃度で一部の脂質種を同定し、定量することができます。この方法は、酵母細胞全体とその精製された小器官のリピドームの評価にうまく適用されています。この方法でエレクトロスプレーイオン化質量分析のための代替移動相添加剤を使用すると、一部の脂質種のイオン化の効率を高めることができ、したがって、それらの同定および定量を改善するために使用することができます。

Introduction

証拠の体は、生体分子の主要なクラスの一つである脂質が真核細胞内の多くの重要なプロセスで不可欠な役割を果たしていることを示しています。これらのプロセスには、細胞小器官を取り巻く細胞膜および膜を構成する脂質二重層の組み立て、細胞膜を越えた小分子の輸送、細胞外環境および細胞内シグナル伝達の変化への応答、エネルギーの生成と貯蔵、異なるオルガネラに閉じ込められたタンパク質の輸出入、内膜系内のタンパク質の静脈密売、および細胞死の数のモードが含まれる 2,3,4,5,6,7,8,9,10.

出芽酵母S.cerevisiaeは、単細胞真核生物であり、これらの重要な細胞プロセスにおける脂質の本質的な役割の根底にあるメカニズムの一部を明らかにするために成功しています4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19,20.S.cerevisiaeは、包括的な生化学的、遺伝的、細胞生物学的、化学的生物学的、システム生物学的、および微小流体解剖分析21、22、23、24、25に適しているため、これらのメカニズムを明らかにするための貴重なモデル生物である。脂質代謝と細胞内輸送がこれらの重要な細胞プロセスに寄与するメカニズムの理解のさらなる進歩には、細胞リピトームの定量的特徴付け、リピドーム分子の複雑性の理解、および定量的リピドミクスをシステム生物学1、2、3、26の学際的プラットフォームに統合するための高感度な質量分析技術が必要である。 27、282930

酵母細胞および他の真核生物の細胞の質量分析支援定量リピドミクスの現在の方法は、十分に汎用性が高くなく、堅牢で、または感受性が高い。また、これらの現在使用されている方法は、種々の同種または異性体脂質種を互いに区別することができない。ここでは、S.cerevisiaeの主要な細胞脂質の定量分析のためのタンデム質量分析(LC-MS/MS)と相まって液体クロマトグラフィーの使用を可能にする汎用性、堅牢、および高感度な方法について説明します。

Protocol

1. 酵母を培養するための滅菌培地の調製 1%(w/v)酵母エキスと2%(w /v)バクトペプトンを含む完全なYP培地の90 mLを調製します。 0.67%(w/v)酵母窒素塩基を含む合成最小YNB培地90 mLを調製し、アミノ酸を含まない酵母窒素塩基、20mg/L-ヒスチジン、30 mg/L L-ロイシン、30mg/L L-リジン、20mg/Lウラシルを調製します。 完全なYP培地の90mLを2つの250 mLのエルレンマイヤー…

Representative Results

LC-MS/MSの助けを借りて酵母細胞内の主要な細胞脂質の定量的評価のための私達の方法は多目的で、強い。当初2%のグルコースを含む合成最小YNB培地で培養されたS.セレビシエ細胞の10種類の脂質クラスを同定し、定量化することができました。これらの脂質クラスには、遊離(未エステル化)脂肪酸(FFA)、CL、フィトセラミド(PHC)、フィトスフィンゴシン(PHS)、PC、PE、…

Discussion

ここで説明するプロトコルの実装を成功させるためには、次の注意事項が重要です。

1. クロロホルムとメタノールは有毒です。それらは実験室のプラスチック製品およびあなたの皮を含む表面から、さまざまな物質を効率よく抽出する。したがって、これらの有機溶媒は、クロロホルムおよび/またはメタノールとの接触を伴うステップでプラスチックの使用を避け、こ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ティトレンコ研究所の現在および元メンバーに話し合いに感謝しています。我々は、質量分析の生物学的応用センター及び構造機能ゲノミクスセンター(両方ともコンコルディア大学)が優れたサービスを提供する。この研究は、カナダの自然科学工学研究評議会(RGPIN 2014-04482)とコンコルディア大学議長基金(CC0113)からの助成金によって支えられました。K.M.はコンコルディア大学功労賞の支援を受けています。

Materials

15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps PYREX 05-550
2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps Fisher Scientific 60180A-SV9-1P
2-Propanol Fisher Scientific A461-500
Acetonitrile Fisher Scientific A9554
Agilent 1100 series LC system Agilent Technologies G1312A
Agilent1100 Wellplate Agilent Technologies G1367A
Ammonium acetate Fisher Scientific A11450
Ammonium bicarbonate Sigma 9830
Ammonium formate Fisher Scientific A11550
Ammonium hydroxide Fisher Scientific A470-250
Bactopeptone Fisher Scientific BP1420-2
Cardiolipin Avanti Polar Lipids 750332
Centra CL2 clinical centrifuge Thermo Scientific 004260F
Ceramide Avanti Polar Lipids 860517
Chloroform Fisher Scientific C297-4
CSH C18 VanGuard Waters 186006944 Pre-column system
Free fatty acid (19:0) Matreya 1028
Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) Sigma-Aldrich G8772
Glucose Fisher Scientific D16-10
Hemacytometer Fisher Scientific 267110
L-histidine Sigma H8125
Lipid Search software (V4.1) Fisher Scientific V4.1 LC-MS/MS analysis software
L-leucine Sigma L8912
L-lysine Sigma L5501
Methanol Fisher Scientific A4564
Phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 850340
Phosphatidylethanolamine Avanti Polar Lipids 850704
Phosphatidylglycerol Avanti Polar Lipids 840446
Phosphatidylinositol Avanti Polar Lipids LM1502
Phosphatidylserine Avanti Polar Lipids 840028
Reverse-phase column CSH C18 Waters 186006102
Sphingosine Avanti Polar Lipids 860669
Thermo Orbitrap Velos MS Fisher Scientific ETD-10600
Tricylglycerol Larodan, Malmo TAG Mixed FA
Ultrasonic sonicator Fisher Scientific 15337416
Uracil Sigma U0750
Vortex Fisher Scientific 2215365
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Yeast nitrogen base without amino acids Fisher Scientific DF0919-15-3
Yeast strain BY4742 Dharmacon YSC1049

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Mohammad, K., Jiang, H., Hossain, M. I., Titorenko, V. I. Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (157), e60616, doi:10.3791/60616 (2020).

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