Summary

Стволовые клетки- производные вирусные Ag-специфические T Лимфоциты подавить HBV репликации у мышей

Published: September 25, 2019
doi:

Summary

Представлен протокол для эффективного подавления вируса гепатита В (HBV) репликации у мышей с помощью приемной передачи клеток (ACT) стволовых клеток полученных вирусных антигенов (Ag)-специфических Т-лимфоцитов. Эта процедура может быть адаптирована для потенциальной аСТ на основе иммунотерапии HBV инфекции.

Abstract

Инфекция, связанная с вирусом гепатита В (HBV), является глобальной проблемой здравоохранения. С более чем 350 миллионов людей, пострадавших во всем мире, HBV инфекции остается ведущей причиной рака печени. Это вызывает серьезную озабоченность, особенно в развивающихся странах. Неспособность иммунной системы смонтировать эффективный ответ против HBV приводит к хронической инфекции. Хотя вакцина против ог. ВГВ присутствует и создаются новые противовирусные препараты, искоренение вирусно-резервуарных клеток остается одной из основных тем для здоровья. Описано здесь метод для генерации вирусного антигена (Ag) -специфические CD8и цитотоксические Т-лимфоциты (CtL), полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) (т.е. iPSC-CTL), которые имеют возможность подавлять репликацию HBV. Репликация HBV эффективно индуцируется у мышей через гидродинамический инъекций плазмиды экспрессии HBV, pAAV/HBV1.2, в печень. Затем, HBV поверхности Ag-специфической мыши iPSC-CTLs являются приемно переданы, что значительно подавляет репликации HBV в печени и крови, а также предотвращает HBV поверхности Ag выражение в гепатоцитов. Этот метод демонстрирует репликацию HBV у мышей после гидродинамических инъекций и что стволовые клетки, полученные вирусных Ag-специфических CTL может подавить репликацию HBV. Этот протокол предоставляет полезный метод иммунотерапии HBV.

Introduction

После острой инфекции адаптивная иммунная система (т.е. гуморальный и клеточный иммунитет) контролирует основную часть острого гепатита, связанного с ВГВ. Тем не менее, ряд людей в Эндемичных регионах HBV не могут устранить вирусы и впоследствии преобразовать в качестве хронических лиц. Более 25% хронических пациентов (250 миллионов человек) во всем мире развивают прогрессирующее заболевание печени, в результате чего цирроз печени и/или гепатоцеллюлярной карциномы (HCC)1. В результате искоренение настойчивых инфицированных клеток остается общей проблемой здоровья, несмотря на то, что имеется вакцина2 и в настоящее время разрабатывается множество противовирусных препаратов. Стандартное лечение HBV-инфекции включает в себя аналоги ИФН-З, нуклеозида и нуклеотида. Эти агенты обладают непосредственной противовирусной активностью и иммуномодулирующими способностями. Тем не менее, сероконверсия HBe антигена (Ag) носители антител (Ab) и потеря сывороточной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) появляются индивидуально примерно у 20% пациентов, а также весь иммунологический контроль вируса проверено лишением HBsAg составляет не более 5%3. Кроме того, реакция на лечение часто не является прочной. Профилактическая вакцинация с помощью рекомбинантных HBs Ag очень эффективна в профилактике инфекции, но терапевтическая вакцинация HBs Ag неэффективна. Очевидно, что При опосредованный Т-клеточными иммунными реакциями играет решающую роль в борьбе с инфекцией ВГВ и нарушением функции печени; однако, в хронических больных гепатитом, HBV-реактивные Т-клетки часто удаляются, дисфункциональные, или конвертировать исчерпаны4,5,6. Следовательно, у людей с постоянной инфекцией ВГВ не удалось ни одного попытки восстановить иммунитет, специфический вХВ (т.е. Т-клеточный иммунитет) с помощью противовирусного средства, иммуномодулирующих цитокинов или лечебной иммунизации.

Приемная передача клеток (ACT) HBV Ag-специфических Т-клеток является эффективным лечением, направленным на то, чтобы в конечном итоге искоренить оставшиеся гепатоциты wih HBV7,8. ACT HBV-специфических CTLs в HBV-инфицированных мышей было показано, что причиной переходного, легкого гепатита, и резкое падение ВГВ рибонуклеиновой кислоты (РНК) стенограммы в гепатоцитов. В этих исследованиях, CTLs не ингибировать транскрипцию генов HBV но усилил деградацию транскриптов HBV9. HBV-специфических CTL важны для предотвращения вирусной инфекции и посредничать в очистке HBV10,11. Для ACT основе средств правовой защиты, in vitro расширение HBV-специфических Т-клеток с высокой реактивностью для переселения in vivo было предложено быть идеальным методом12,13,14; тем не менее, нынешние подходы ограничены в отношении их способности генерировать, отделять и расти соответствующие количества и качества HBV-специфических Т-клеток от пациентов для потенциальных методов лечения.

Хотя клинические испытания представляют безопасность, осуществимость и перспективную терапевтическую активность клеточного лечения с помощью инженерных Т-клеток, которые специфичны для Инфицированных вирусом ВпГ гепатоцитов, есть опасения по поводу неблагоприятных последствий происходящих из аутоиммунных реакций из-за перекрестной реактивности от неправильного T-клеточного рецептора (TCR)15,16, вне целевого распознавания Ag неспецифическим TCR17 и на цель вне токсичности химерных рецепторов Ag (CAR) 18 лет , 19 со здоровыми тканями. В настоящее время генетически модифицированные Т-клетки, которые имеют только краткосрочную стойкость in vivo, обычно являются промежуточными или более поздними Т-клетками. На сегодняшний день, плюрипотентные стволовые клетки (PSCs) являются единственным источником для создания большого количества наивных однотипных Ag-специфических Т-клеток20,21,22,23. Индуцированные ПЦ (iPSCs) просто преобразуются из соматических клеток пациента с помощью трансдукции генов нескольких транскрипционных факторов. В результате, iPSCs имеют те же характеристики, как у эмбриональных стволовых клеток (ESCs)24. Благодаря гибкости и возможности для бесконечной способности к самообновлению, в дополнение к замене тканей, iPSC основе лечения могут быть широко применены в регенеративной медицине. Кроме того, полки, лежащие в основе iPSCs, могут существенно улучшить текущую клеточную терапию.

Общая цель этого метода заключается в генерации большого количества HBV-специфических CtLs из iPSCs (т.е. iPSC-CTLs) для иммунотерапии на основе АКТ. Преимущества по сравнению с альтернативными методами в том, что HBV-специфические iPSC-CTL имеют однотипный TCR и наивный фенотип, что приводит к большему развитию Т-клеток памяти после ACT. Показано, что ACT HBV-специфических iPSC-CTLs увеличивает миграцию функциональных CD8и Т-клеток в печени и уменьшает репликацию HBV как в печени, так и в крови управляемых мышей. Этот метод показывает потенциальное использование вирусных Ag-специфических iPSC-CTL для иммунотерапии HBV и может быть адаптирован для генерации других вирусных Ag-специфических iPSC-T-клеток для вирусной иммунотерапии.

Protocol

Все эксперименты на животных одобрены Комитетом по уходу за животными Техасского университета (IACUC; #2018-0006) и проводятся в соответствии с руководящими принципами Ассоциации по оценке и аккредитации лабораторных животных. Мыши используются в возрасте 6-9 недель. 1. Поколение…

Representative Results

Как показано здесь, HBV вирусных Ag-специфических iPSC-CD8и Т-клетки генерируются системой культуры in vitro. После ACT этих вирусных Ag-специфических iPSC-CD8- Т-клеток существенно подавляют репликацию HBV в модели мурина(Дополнительный файл 1). Мышь iPSC трансумции с MIDR ретровирусной…

Discussion

Этот протокол представляет собой метод для создания вирусных Ag-специфических iPSC-CTLs для использования в качестве ACT для подавления репликации HBV в модели murine. При хронической инфекции HBV вирусный геном образует стабильную мини-хромосому, ковалентно закрытую круговую ДНК (cccDNA), которая мо…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят д-ра Адама J Геринга из Торонто больницы научно-исследовательский институт для предоставления cDNA для HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI) – конкретные A2-ограниченный человек-мурин гибридных генов TCR, и д-р Пей-Джер Чен из Национального университета Тайваня для обеспечения конструкция pAAV/HBV 1.2. Эта работа поддерживается Национальным институтом здравоохранения Грант R01AI121180, R01CA221867 и R21AI109239 до J. S.

Materials

HHD mice Institut Pasteur, Paris, France H-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic (HHD) mice
iPS-MEF-Ng-20D-17 RIKEN Cell Bank APS0001
SNL76/7 ATCC SCRC-1049
OP9 ATCC CRL-2749
pAAV/HBV1.2 plasmid Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan) HBV DNA construct
HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-specific TCR genes Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada) FLLTRILTI-specific A2-restricted human-murine hybrid TCR genes (Vα34 and Vβ28)
OVA257–264-specific TCR genes Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA) SIINFEKL-specific H-2Kb-restricted TCR genes
Anti-CD3 (17A2) antibody Biolegend 100236
Anti-CD44 (IM7) antibody BD Pharmingen 103012
Anti-CD4 (GK1.5) antibody Biolegend 100408
Anti-CD8 (53-6.7) antibody Biolegend 100732
Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody Biolegend 505810
Anti-TNF-a (MP6-XT22) antibody Biolegend 506306
α-MEM Invitrogen A10490-01
Anti-HBs antibody Thermo Fisher MA5-13059
ACK Lysis buffer Lonza 10-548E
Brefeldin A Sigma B7651
DMEM Invitrogen ABCD1234
FBS Hyclone SH3007.01
FACSAria Fusion cell sorter BD 656700
Gelatin MilliporeSigma G9391
GeneJammer Agilent 204130
HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer Proimmune F027-4A – 27
HRP Anti-Mouse Secondary Antibody Invitrogen A27025
mFlt-3L Peprotech 250-31L
mIL-7 Peprotech 217-17
Nuclease S7 Roche 10107921001
Paraformaldehyde MilliporeSigma P6148-500G Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
Permeabilization buffer Biolegend 421002
Polybrene MilliporeSigma 107689
ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI Invitrogen P36931
QIAamp MinElute Virus Spin Kit Qiagen 57704

References

  1. Scaglione, S. J., Lok, A. S. Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice. Gastroenterology. 142 (6), 1360-1368 (2012).
  2. Osiowy, C. From infancy and beyond… ensuring a lifetime of hepatitis B virus (HBV) vaccine-induced immunity. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (8), 2093-2097 (2018).
  3. Gish, R. G., et al. Loss of HBsAg antigen during treatment with entecavir or lamivudine in nucleoside-naive HBeAg-positive patients with chronic hepatitis B. Journal of Viral Hepatitis. 17 (1), 16-22 (2010).
  4. Kurktschiev, P. D., et al. Dysfunctional CD8+ T cells in hepatitis B and C are characterized by a lack of antigen-specific T-bet induction. Journal of Experimental Medicine. 211 (10), 2047-2059 (2014).
  5. Fisicaro, P., et al. Antiviral intrahepatic T-cell responses can be restored by blocking programmed death-1 pathway in chronic hepatitis B. Gastroenterology. 138 (2), 682-693 (2010).
  6. Schurich, A., et al. The third signal cytokine IL-12 rescues the anti-viral function of exhausted HBV-specific CD8 T cells. PLoS Pathogens. 9 (3), 1003208 (2013).
  7. Gehring, A. J., et al. Engineering virus-specific T cells that target HBV infected hepatocytes and hepatocellular carcinoma cell lines. Journal of Hepatology. 55 (1), 103-110 (2011).
  8. Xia, Y., et al. Interferon-gamma and Tumor Necrosis Factor-alpha Produced by T Cells Reduce the HBV Persistence Form, cccDNA, Without Cytolysis. Gastroenterology. 150 (1), 194-205 (2016).
  9. Huang, L. R., Wu, H. L., Chen, P. J., Chen, D. S. An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (47), 17862-17867 (2006).
  10. Wong, P., Pamer, E. G. CD8 T cell responses to infectious pathogens. Annual Review of Immunology. 21, 29-70 (2003).
  11. Murray, J. M., Wieland, S. F., Purcell, R. H., Chisari, F. V. Dynamics of hepatitis B virus clearance in chimpanzees. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (49), 17780-17785 (2005).
  12. Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 106 (41), 17469-17474 (2009).
  13. Hinrichs, C. S., et al. Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy. Blood. 117 (3), 808-814 (2011).
  14. Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. Journal of Immunotherapy. 34 (4), 343-352 (2011).
  15. Kuball, J., et al. Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into human T cells. Blood. 109 (6), 2331-2338 (2007).
  16. van Loenen, M. M., et al. Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (24), 10972-10977 (2010).
  17. Cameron, B. J., et al. Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells. Science Translational Medicine. 5 (197), (2013).
  18. Fedorov, V. D., Themeli, M., Sadelain, M. PD-1- and CTLA-4-based inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) divert off-target immunotherapy responses. Science Translational Medicine. 5 (215), (2013).
  19. Maus, M. V., et al. T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans. Cancer Immunolology Research. 1 (1), 26-31 (2013).
  20. Haque, R., et al. Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity. Journal of Immunology. 189 (3), 1228-1236 (2012).
  21. Vizcardo, R., et al. Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).
  22. Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).
  23. Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. 癌症研究. 71 (14), 4742-4747 (2011).
  24. Kim, J. B., et al. Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells. Cell. 136 (3), 411-419 (2009).
  25. Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (63), e3986 (2012).
  26. Lei, F., Haque, M., Sandhu, P., Ravi, S., Ni, Y., Zheng, S., Fang, D., Jia, H., Yang, J. M., Song, J. Development and characterization of naive single-type tumor antigen-specific CD8+ T lymphocytes from murine pluripotent stem cells. OncoImmunology. 6, (2017).
  27. Haque, M., et al. Melanoma Immunotherapy in Mice Using Genetically Engineered Pluripotent Stem Cells. Cell Transplantation. 25 (5), 811-827 (2016).
  28. Tan, A. T., et al. Use of Expression Profiles of HBV DNA Integrated Into Genomes of Hepatocellular Carcinoma Cells to Select T Cells for Immunotherapy. Gastroenterology. , (2019).
  29. Wu, L. L., et al. Ly6C(+) Monocytes and Kupffer Cells Orchestrate Liver Immune Responses Against Hepatitis B Virus in Mice. Hepatology. , (2019).
  30. Haque, M., et al. Stem cell-derived tissue-associated regulatory T cells suppress the activity of pathogenic cells in autoimmune diabetes. Journal of Clinical Investigation Insights. , (2019).
  31. Chisari, F. V., et al. Structural and pathological effects of synthesis of hepatitis B virus large envelope polypeptide in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 84 (19), 6909-6913 (1987).
  32. Wirth, S., Guidotti, L. G., Ando, K., Schlicht, H. J., Chisari, F. V. Breaking tolerance leads to autoantibody production but not autoimmune liver disease in hepatitis B virus envelope transgenic mice. Journal of Immunology. 154 (5), 2504-2515 (1995).

Play Video

Cite This Article
Xiong, X., Lei, F., Haque, M., Song, J. Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice. J. Vis. Exp. (151), e60043, doi:10.3791/60043 (2019).

View Video