Summary

Очистка высокомолекулярного массового белка в streptococcus mutans

Published: September 14, 2019
doi:

Summary

Описан опростываемый здесь простой метод очистки генного продукта в Streptococcus mutans. Этот метод может быть выгодным в очищении белков, особенно мембранных белков и белков высокой молекулярной массы, и может быть использован с различными другими бактериальными видами.

Abstract

Разочаивание функции гена обычно включает в себя сравнение фенотипических признаков штаммов дикого типа и штаммов, в которых ген интереса был нарушен. Потеря функции после нарушения гена впоследствии восстанавливается экзогенным добавлением продукта нарушенного гена. Это помогает определить функцию гена. Метод, описанный ранее включает в себя генерацию gtfC гена нарушенных Streptococcus мутанов штамма. Здесь описан нетребовательный метод для очистки генного продукта gtfC от недавно сгенерированного штамма S. mutans после нарушения гена. Она включает в себя добавление последовательность полихиститидина кодирования на 3 “конец гена интереса, что позволяет простой очистки гена продукта с использованием иммобилизованных хроматографии сродства металла. Для генетической модификации этого метода не требуется никаких ферментативных реакций, кроме ПЦР. Восстановление генного продукта путем экзогенного добавления после нарушения гена является эффективным методом определения функции гена, который также может быть адаптирован к различным видам.

Introduction

Анализ функции гена обычно включает в себя сравнение фенотипических признаков штаммов дикого типа с штаммами, в которых ген интереса был нарушен. Как только ген-нарушенный напряжение произведено, экзогенное добавление продукта гена позволяет функциональное восстановление.

Наиболее распространенным методом получения очищенных генных продуктов, необходимых для последующего восстановления анализов является выполнение гетерологического выражения в Escherichia coli1. Однако, выражение мембранных белков или белков высокой молекулярной массы часто трудно использовать эту систему1. В этих случаях, целевой белок, как правило, изолированы из клеток, которые родно синтезирует белок через комплекс ряд шагов, которые могут привести к потере генного продукта. Чтобы преодолеть эти проблемы, простая процедура была разработана для очистки генного продукта после метода нарушения гена2,ПЦР на основе метода сращивания ДНК3 (обозначенный двухступенчатый фьюжн ПЦР), и электропорации для генетической преобразование в Streptococcus mutans. Добавление тега полихистидина (His-tag) к C-термину с генным продуктом облегчает его очистку путем обездвижения хроматографии сродства металла (IMAC).

Чтобы изолировать его-тег-выражение штамма, вся геномная ДНК гена интереса (в этом Его-тег-выражение гена нарушенных штамма) заменяется антибиотикорезистентный маркер гена. Процедура для генерации Его-тег-выражение strainis почти идентичны, что для генерации гена нарушенных штамма, как описано ранее4,5. Поэтому методы нарушения генов и изоляции генного продукта должны выполняться в качестве последовательных экспериментов для функционального анализа.

В настоящей работе, последовательность политистидина-кодирования прилагается к 3 “конец gtfC (GenBank локус тег SMU-1005) ген, кодирование glucosyltransferase-SI (GTF-SI) в S. mutans6. Затем были проведены экспрессионные исследования стрептококковых видов. Достижение гетерологичного выражения gtfC E. coli затруднено, вероятно, из-за высокой молекулярной массы GTF-SI. Этот штамм называется S. mutans His-gtfC. Схематическая иллюстрация, изображающая организацию кассеты гена gtfC и spectomycin resistance(spcr)7 локусов в диком типе S. mutans (S. mutans WT) и его производных показана в Рисунок 1. GTF-SI является секреторным белком, который способствует развитию кариогенной стоматологической биопленки6. При наличии сахарозы, адепт биопленка наблюдается на гладкой стеклянной поверхности в WT S. mutans штамма, но не в S. mutans gtfC-нарушенныйштамм (S. mutans s gtfC)2,5 . Формирование биопленки восстанавливается в S. mutans sgtfC при экзогенном добавлении рекомбинантного GTF-SI. Штамм, S. mutans His-gtfC, затем используется для производства рекомбинантных GTF-SI.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Поколение S. mutans sgtfC, в котором вся область кодирования гена gtfC заменяется spcr, должна быть завершена до выполнения этих протоколов. Обратитесь к опубликованной статье для получения подробной информации о поколении5. <p class="jove_tit…

Representative Results

На рисунке 3 показан размер каждого ампромтона от первого ПЦР(рисунок 3A)и второго ПЦР(рисунок 3B). Размер каждого амблона соответствовал прогнозируемому размеру, как описано в таблице 1. На рисунке 4A</str…

Discussion

Конструкция грунтовок является наиболее важным шагом в протоколе. Последовательности gtfC-обратнойи spcr-forwardпраймеры были автоматически определены на основе последовательностей как 3 “конец области gtfC и 5″ конец области spcr. Каждый праймер включает в себя 24 д…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Японским обществом содействия науке (JSPS) (гранты 16K15860 и 19K10471 до Т. М., 17K12032 до М. И., и 18K09926 н. Х.) и SECOM Научно-технический фонд (SECOM) (грант No 2018.09.

Materials

Agarose Nippon Genetics NE-AG02 For agarose gel electrophoresis
Anaeropack Mitsubishi Gas Chemical A-03 Anaerobic culture system
Anti-His-Tag monoclonal antibody MBL D291-7 HRP-conjugated
BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific 23227 Measurement of protein concentration
Brain heart infusion broth Becton, Dickinson 237500 Bacterial culture medium
CBB R-250 Wako 031-17922 For biofilm staining
Centrifugal ultrafiltration unit Sartorius VS2032 Buffer replacement and protein concentration
Centrifuge Kubota 7780II
Chromatographic column Bio-Rad 7321010 For IMAC
Dialysis membrane clamp Fisher brand 21-153-100
Dialysis tubing As One 2-316-06
DNA polymerase Takara R045A High-fidelity DNA polymerase
DNA sequencing Eurofins Genomics
ECL substrate Bio-Rad 170-5060 For western blotting
EDTA (0.5 M pH 8.0) Wako 311-90075 Tris-EDTA buffer preparation
Electroporation cuvette Bio-Rad 1652086 0.2 cm gap
Electroporator Bio-Rad 1652100
EtBr solution Nippon Gene 315-90051 For agarose gel electrophoresis
Gel band cutter Nippon Genetics FG-830
Gel extraction kit Nippon Genetics FG-91202 DNA extraction from agarose gel
Imager GE Healthcare 29083461 For SDS-PAGE and western blotting
Imidazole Wako 095-00015 Binding buffer and elution buffer preparation
Incubator Nippon Medical & Chemical Instruments EZ-022 Temperature setting: 4 °C
Incubator Nippon Medical & Chemical Instruments LH-100-RDS Temperature setting: 37 °C
Membrane filter Merck Millipore JGWP04700 0.2 µm diameter
Microcentrifuge Kubota 3740
NaCl Wako 191-01665 Preparation of binding buffer and elution buffer
NaH2PO4·2H2O Wako 192-02815 Preparation of binding buffer and elution buffer
NaOH Wako 198-13765 Preparation of binding buffer and elution buffer
(NH4)2SO4 Wako 015-06737 Ammonium sulfate precipitation
Ni-charged resin Bio-Rad 1560133 For IMAC
PCR primers Eurofins Genomics Custom-ordered
Protein standard Bio-Rad 161-0381 For SDS-PAGE and western blotting
Solvent filtration apparatus As One FH-1G
Spectinomycin Wako 195-11531 Antibiotics; use at 100 μg/mL
Sterile syringe filter Merckmillipore SLGV004SL 0.22 µm diameter
Streptococus mutans ΔgtfC Stock strain in the lab. gtfC replaced with spcr
Streptococus mutans UA159 Stock strain in the lab. S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain
Sucrose Wako 196-00015 For biofilm development
TAE (50 × ) Nippon Gene 313-90035 For agarose gel electrophoresis
Thermal cycler Bio-Rad PTC-200
Tris-HCl (1 M, pH 8.0) Wako 314-90065 Tris-EDTA buffer preparation

References

  1. Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , (2001).
  2. Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product. Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).
  3. Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
  4. Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).
  5. Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
  6. Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).
  7. LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).
  8. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
  9. Database, J. S. E. PCR: The Polymerase Chain Reaction. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  10. Database, J. S. E. DNA Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  11. Database, J. S. E. Gel Purification. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  12. Wingfield, P. T. Protein precipitation using ammonium sulfate. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
  13. Database, J. S. E. Separating Protein with SDS-PAGE. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  14. Database, J. S. E. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  15. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  16. Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).
  17. Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
  18. Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).

Play Video

Cite This Article
Murata, T., Yamashita, M., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (151), e59804, doi:10.3791/59804 (2019).

View Video