Summary

Purificação de uma proteína de massa molecular elevada em Streptococcus mutans

Published: September 14, 2019
doi:

Summary

Descrito aqui é um método simples para a purificação de um produto genético em Streptococcus mutans. Esta técnica pode ser vantajosa na purificação de proteínas, especialmente proteínas de membrana e proteínas de massa molecular elevada, podendo ser utilizada com várias outras espécies bacterianas.

Abstract

O elucidation da função de um gene envolve tipicamente a comparação de traços fenotípicos de estirpes e de tensões do selvagem-tipo em que o gene do interesse foi interrompido. A perda da função que segue o rompimento do gene é restaurada subseqüentemente pela adição exógena do produto do gene interrompido. Isso ajuda a determinar a função do gene. Um método descrito anteriormente envolve a geração de uma cepa de Streptococcus mutans com ruptura de gene gtfc . Aqui, um método não exigente é descrito para purificar o produto do gene Gtfc da estirpe de S. mutans recém-gerada após o rompimento do gene. Envolve a adição de uma seqüência da polyhistidine-Coding na extremidade 3 do ′ do gene do interesse, que permite a purificação simples do produto do gene usando a cromatografia de afinidade imobilizada do metal. Não são necessárias reações enzimáticas para além da PCR para a modificação genética neste método. A restauração do produto genético por adição exógena após o rompimento genético é um método eficiente para determinar a função gênica, que também pode ser adaptada a diferentes espécies.

Introduction

A análise de um gene ‘ a função de s envolve geralmente a comparação de traços fenotípicos de estirpes do selvagem-tipo às tensões em que o gene do interesse foi interrompido. Uma vez que a estirpe de gene-disrupted é produzida, a adição exógena do produto do gene permite a restauração funcional.

O método mais comum para a obtenção de produtos gênicos purificados necessários para os ensaios subsequentes de restauração é a realização de expressão heteróloga em Escherichia coli1. No entanto, a expressão de proteínas de membrana ou proteínas de alta massa molecular é muitas vezes difícil usando este sistema1. Nestes casos, a proteína alvo é geralmente isolada das células que sintetiza nativamente a proteína através de uma série complexa de etapas, o que pode levar à perda do produto genético. Para superar estas edições, um procedimento simples foi desenvolvido para a purificação do produto do gene que segue um método2do rompimento do gene, método de emenda PCR-baseado do ADN3 (PCR designado da fusão da dois-etapa), e Electroporation para genético transformação em Streptococcus mutans. A adição de uma etiqueta do polyhistidine (His-tag) ao C-Terminus do produto do gene facilita sua purificação pela cromatografia de afinidade imobilizada do metal (IMAC).

Para isolar a estirpe his-tag-expressando, o ADN genomic inteiro do gene do interesse (neste seu-Tag-expressando a tensão gene-disrupted) é substituído com um gene antibiótico-resistente do marcador. O procedimento para gerar o seu-Tag-expressando strainis quase idêntico àquele para gerar uma tensão gene-interrompida como descrita previamente4,5. Conseqüentemente, os métodos para o rompimento do gene e o isolamento do produto do gene devem ser executados como experimentos seriais para a análise funcional.

No presente trabalho, uma seqüência de codificação de polihistidina é anexada à extremidade 3 ′ do gene Gtfc (GenBank Locus tag SMU_1005), codificando glucosyltransferase-si (GTF-si) em S. mutans6. Em seguida, foram realizados estudos de expressão em espécie estreptocócica. Conseguir a expressão heterólogo de gtfc por E. coli é difícil, provável por causa da massa molecular elevada de GTF-si. Esta estirpe chama-se S. mutans his-gtfc. Uma ilustração esquemática que descreve a organização da gaveta do gene da resistência de gtfc e de espectinomicina (SPCr)7 loci em Wild-Type s. mutans (s. mutans WT) e seus derivados é mostrado em Figura 1. O GTF-SI é uma proteína secretora que contribui para o desenvolvimento do biofilme dental cariogênico6. a presença de sacarose, um biofilme aderente é observado em uma superfície de vidro liso na estirpe de WT s. mutans , mas não na estirpe de s. mutans gtfc-disrupted (s. mutans Δgtfc)2,5 . A formação de biofilme é restaurada em S. mutans Δgtfc após adição exógena do GTF-si recombinante. A cepa, S. mutans his-gtfc, é então usada para produzir o GTF-si recombinante.

Protocol

Nota: Geração de S. mutans ∆gtfc, em que toda a região codificadora do gene gtfc é substituída por SPCr, deve ser completada antes da realização desses protocolos. Consulte o artigo publicado para obter detalhes sobre a geração5. 1. projeto da primeira demão Prepare primers para a construção de S. mutans his-gtfc.Nota: As sequ?…

Representative Results

A Figura 3 mostra o tamanho de cada amplicon a partir da primeira PCR (Figura 3a) e da segunda PCR (Figura 3B). O tamanho de cada amplicon correspondeu ao tamanho previsto, conforme descrito na tabela 1. A figura 4a mostra S. as colônias de mutans transformadas com o segundo produto do PCR e chapearam nas placas do agar de BHI que contêm o spe…

Discussion

O projeto de primers é o passo mais crítico do protocolo. As sequências dos primers gtfc-Reverse e SPCr-Forward foram automaticamente determinadas com base nas sequências da região final de 3 ′ do gtfc e da região final de 5 ′ do SPCr. Cada primer inclui 24 bases complementares que codificam um vinculador GS e uma sequência de codificação his-tag em suas 5 ‘ regiões. O rompimento das seqüências reguladoras nativas situadas nas regiões flanqueando …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela sociedade japonesa para a promoção da ciência (JSPS) (números de subvenção 16K15860 e 19K10471 para T. M., 17K12032 a M. I., e 18K09926 a N. H.) e a Fundação de ciência e tecnologia da SECOM (SECOM) (número de subvenção 2018.09.10 n º 1).

Materials

Agarose Nippon Genetics NE-AG02 For agarose gel electrophoresis
Anaeropack Mitsubishi Gas Chemical A-03 Anaerobic culture system
Anti-His-Tag monoclonal antibody MBL D291-7 HRP-conjugated
BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific 23227 Measurement of protein concentration
Brain heart infusion broth Becton, Dickinson 237500 Bacterial culture medium
CBB R-250 Wako 031-17922 For biofilm staining
Centrifugal ultrafiltration unit Sartorius VS2032 Buffer replacement and protein concentration
Centrifuge Kubota 7780II
Chromatographic column Bio-Rad 7321010 For IMAC
Dialysis membrane clamp Fisher brand 21-153-100
Dialysis tubing As One 2-316-06
DNA polymerase Takara R045A High-fidelity DNA polymerase
DNA sequencing Eurofins Genomics
ECL substrate Bio-Rad 170-5060 For western blotting
EDTA (0.5 M pH 8.0) Wako 311-90075 Tris-EDTA buffer preparation
Electroporation cuvette Bio-Rad 1652086 0.2 cm gap
Electroporator Bio-Rad 1652100
EtBr solution Nippon Gene 315-90051 For agarose gel electrophoresis
Gel band cutter Nippon Genetics FG-830
Gel extraction kit Nippon Genetics FG-91202 DNA extraction from agarose gel
Imager GE Healthcare 29083461 For SDS-PAGE and western blotting
Imidazole Wako 095-00015 Binding buffer and elution buffer preparation
Incubator Nippon Medical & Chemical Instruments EZ-022 Temperature setting: 4 °C
Incubator Nippon Medical & Chemical Instruments LH-100-RDS Temperature setting: 37 °C
Membrane filter Merck Millipore JGWP04700 0.2 µm diameter
Microcentrifuge Kubota 3740
NaCl Wako 191-01665 Preparation of binding buffer and elution buffer
NaH2PO4·2H2O Wako 192-02815 Preparation of binding buffer and elution buffer
NaOH Wako 198-13765 Preparation of binding buffer and elution buffer
(NH4)2SO4 Wako 015-06737 Ammonium sulfate precipitation
Ni-charged resin Bio-Rad 1560133 For IMAC
PCR primers Eurofins Genomics Custom-ordered
Protein standard Bio-Rad 161-0381 For SDS-PAGE and western blotting
Solvent filtration apparatus As One FH-1G
Spectinomycin Wako 195-11531 Antibiotics; use at 100 μg/mL
Sterile syringe filter Merckmillipore SLGV004SL 0.22 µm diameter
Streptococus mutans ΔgtfC Stock strain in the lab. gtfC replaced with spcr
Streptococus mutans UA159 Stock strain in the lab. S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain
Sucrose Wako 196-00015 For biofilm development
TAE (50 × ) Nippon Gene 313-90035 For agarose gel electrophoresis
Thermal cycler Bio-Rad PTC-200
Tris-HCl (1 M, pH 8.0) Wako 314-90065 Tris-EDTA buffer preparation

References

  1. Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , (2001).
  2. Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product. Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).
  3. Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
  4. Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).
  5. Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
  6. Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).
  7. LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).
  8. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
  9. Database, J. S. E. PCR: The Polymerase Chain Reaction. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  10. Database, J. S. E. DNA Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  11. Database, J. S. E. Gel Purification. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  12. Wingfield, P. T. Protein precipitation using ammonium sulfate. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
  13. Database, J. S. E. Separating Protein with SDS-PAGE. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  14. Database, J. S. E. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  15. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  16. Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).
  17. Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
  18. Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).

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Cite This Article
Murata, T., Yamashita, M., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (151), e59804, doi:10.3791/59804 (2019).

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