Summary

Geração de células-tronco neurais induzidas de células mononucleares periféricas e diferenciação para precursores de neurónios dopaminérgicos para estudos de transplante

Published: July 11, 2019
doi:

Summary

O protocolo apresenta a reprogramação de células mononucleares do sangue periférico para induzir células-tronco neurais por infecção pelo vírus de Sendai, diferenciação de iNSCs em neurônios dopaminérgicos, transplante de precursores da DA na unilateralmente lesionada Modelos do rato da doença de Parkinson, e avaliação da segurança e da eficácia de precursores DA DA do iNSC-derivados para o tratamento do paládio.

Abstract

A doença de Parkinson (DP) é causada pela degeneração dos neurônios dopaminérgicos (da) no substância negra nigra pars compacta (SNPC) no mesencon ventral (VM). A terapia da recolocação da pilha prende a grande promessa para o tratamento do paládio. recentemente, as pilhas de haste neural induzidas (iNSCs) emergiram como um candidato potencial para a terapia da recolocação da pilha devido ao risco reduzido da formação do tumor e da plasticidade para dar o aumento neurônios específicos da região e glia. os iNSCs podem ser reprogramados a partir de fontes celulares somáticas autólogas, como fibroblastos, células mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) e vários outros tipos de células. Comparado com outros tipos de células somáticas, PBMNCs são um tipo de célula iniciante atraente por causa da facilidade de acesso e expansão na cultura. O vírus de Sendai (SeV), um vírus não integrativo do RNA, codificando fatores de reprogramação que incluem o OCT3/4humano, SOX2, KLF4 e c-Myc, tem um genoma negativo-sentido, único-encalhado, não-segmentado que não integre em genoma do hospedeiro, mas apenas Replica no citoplasma de células infectadas, oferecendo um veículo eficiente e seguro para a reprogramação. Neste estudo, nós descrevemos um protocolo em que o iNSCs é obtido reprogramando PBMNCs, e diferenciado em neurônios especializados DA VM DA por um método Two-stage. Então os precursores são transplantados em modelos unilateralmente 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned do rato do paládio para avaliar a segurança e a eficácia para o tratamento do paládio. Este método fornece uma plataforma para investigar as funções e os efeitos terapêuticos de células neurais DA DA do paciente-específicas in vitro e in vivo.

Introduction

A doença de Parkinson (DP) é uma desordem neurodegenerativa comum, causada pela degeneração dos neurônios dopaminérgicos (da) no substância negra nigra pars compacta (SNPC) no mesencéfalo ventral (VM), com uma prevalência de mais de 1% na população acima de 60 anos de idade 1. º , 2. ao longo da década passada, a terapia celular, destinada a substituir as células degenerativas ou danificadas, ou Nutrir o microambiente em torno dos neurônios degenerativos, mostrou potencial no tratamento de PD3. Enquanto isso, a tecnologia de reprogramação fez progressos significativos4, que fornece uma fonte celular promissora para a terapia de reposição. As pilhas de haste pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) e as pilhas de haste embrionário (ESCS) foram provadas ser capazes de diferenciar-se em pilhas neural de da, que poderiam sobreviver, maturate, e melhorar as funções de motor quando enxertadas em ratos e em modelos não-humanos do PD do primata5 ,6,7,8. os iPSCs representam um marco nas tecnologias de reprogramação celular e têm um grande potencial de transplante celular; Entretanto, há ainda uma preocupação sobre o risco de formação tumoral a partir das células incompletamente diferenciadas. Uma fonte celular alternativa para o transplante de células é células-tronco adultas comprometidas por linhagem obtidas por meio de reprogramação direta, como células-tronco neurais induzidas (iNSCs), que podem ser derivadas dos intermediários instáveis, ignorando a pluripotência etapa9,10,11.

Tanto o iPSCs quanto o inscs podem ser reprogramados a partir de fontes celulares autólogas, como fibroblastos, células mononucleares do sangue periférico (pbmncs) e vários outros tipos de células12,13,14, reduzindo assim a imunogenicidade das células transplantadas em grande grau. Além disso, comparado com iPSCs, os iNSCs são inerentes com risco reduzido da formação do tumor e da plasticidade linhagem-comprometida, somente capaz de diferenciar-se em neurônios e em glia11. Nos estudos iniciais, os iPSCs humano ou camundongo e os inscs foram gerados a partir de fibroblastos obtidos a partir de biópsias cutâneas, o que é um procedimento invasivo14,15. Com este respeito, os PBMNCs são uma fonte de célula de partida atraente por causa do processo de amostragem menos invasivo, e a facilidade de obter um grande número de células dentro de um curto período de tempo de expansão16. Os estudos de reprogramação inicial empregaram sistemas integrativos de entrega, como vetores lentivirais ou anti-retrovirais, que são eficientes e fáceis de implementar em muitos tipos de células17; no entanto, esses sistemas de parto podem causar mutações e reativação de transgenes residuais, que apresentam problemas de segurança para fins terapêuticos clínicos12. O vírus de Sendai (SeV) é um vírus de RNA não integrativo com um genoma de sentido negativo, único que não se integra no genoma do hospedeiro, mas apenas Replica no citoplasma de células infectadas, oferecendo um veículo eficiente e seguro para reprogramar18 ,19. Os vetores de SeV recombinantes estão disponíveis que contêm fatores de reprogramação, incluindo OCT3/4, SOX2, KLF4 e c-Myc humanos em seus quadros de leitura abertos. Além disso, os vetores virais SeV podem ser melhorados através da introdução de mutações sensíveis à temperatura, para que possam ser rapidamente removidas quando a temperatura da cultura é aumentada para 39 ° c20. Neste artigo, descrevemos um protocolo para reprogramar PBMNCs para iNSCs usando o sistema SeV.

Muitos estudos relataram a derivação dos neurônios da ESCS humana ou iPSCs usando vários métodos6,8,21. No entanto, há uma escassez de protocolos descrevendo a diferenciação de neurônios da da iNSCs em detalhes. Neste protocolo, descreveremos a geração eficiente de neurônios da do iNSCs usando um método de dois estágios. Os precursores neuronais DA DA podem ser transplantados para o estriado de modelos de mouse PD para avaliações de segurança e eficácia. Este artigo apresentará um protocolo detalhado que cubra vários estágios da geração de pilhas de haste neural induzidas pelo vírus de Sendai, diferenciação de inscs em neurônios da da, estabelecimento de modelos do PD do rato, à transplantação de precursores do da no estriado dos modelos de PD. Usando este protocolo, pode-se gerar iNSCs de pacientes e doadores saudáveis e derivar neurônios DA DA que são seguros, padronáveis, escalonáveis e homogêneos para fins de transplante celular, ou para modelar PD em um prato e investigação dos mecanismos início e desenvolvimento da doença subjacente.

Protocol

Todos os procedimentos devem seguir as diretrizes do Comitê institucional de ética em pesquisa humana. O consentimento informado deve ser obtido de pacientes ou voluntários saudáveis antes da coleta de sangue. Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de ética em pesquisa humana da instituição e foi realizado de acordo com as diretrizes da instituição para o cuidado e uso de animais. 1. recolha, isolamento e expansão de PBMNCs Coleção de PBMNCs C…

Representative Results

Aqui, nós relatamos um protocolo que cubra estágios diferentes da terapia da pilha de iNSC-DA para tratar modelos do paládio. Primeiramente, os PBMNCs foram isolados e expandidos, e reprogramados em iNSCs pela infecção de SeV. Uma representação esquemática dos procedimentos com expansão de PBMNC e indução de iNSC é mostrada na Figura 1. No dia-14, os PBMNCs foram isolados usando um meio de gradiente de densidade (tabela de materiais). Antes da centrifugação, o …

Discussion

Aqui nós apresentamos um protocolo que cobria estágios diferentes da terapia da pilha de iNSC-DA para modelos do paládio. Os aspectos críticos deste protocolo incluem: (1) isolação e expansão de pbmncs e reprogramação de pbmncs em inscs pela infecção de Sev, (2) diferenciação de inscs aos neurônios de da, (3) estabelecimento de modelos unilaterais do rato do PD 6-OHDA-lesioned e comportamento avaliação e (4) transplante celular de precursores DA DA e avaliação comportamental.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O trabalho foi apoiado pelas seguintes subvenções: célula-tronco e tradução do projeto chave nacional (2016YFA0101403), Fundação Nacional de ciências naturais da China (81661130160, 81422014, 81561138004), Fundação Municipal de ciência natural de Pequim (5142005), Fundação dos talentos de Beijing (2017000021223TD03), projeto da sustentação de professores de nível elevado em universidades municipais de Beijing no período do 13º plano do cinco-ano (CIT & TCD20180333), concessão de talento de nível elevado do sistema médico de Beijing (2015-3-063), Beijing Fundo da Comissão Municipal de saúde (PXM 2018_026283_000002), Pequim 100, mil e 10000 fundo de talentos (2018A03), administração municipal de Pequim de hospitais de medicina clínica desenvolvimento de apoio especial de financiamento (ZYLX201706), e os Royal Society-Newton bolsa avançada (NA150482).

Materials

15-ml conical tube Corning 430052
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M6145 Toxic for inhalation and skin contact
24-well plate Corning 3337
50-ml conical tube  Corning 430828
6-OHDA Sigma-Aldrich H4381
6-well plate Corning 3516
Accutase Invitrogen A11105-01 Cell dissociation reagent
Apomorphine Sigma-Aldrich A4393
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A92902 Toxic with skin contact 
B27 supplement  Invitrogen 17504044
BDNF Peprotech 450-02 Brain derived neurotrophic factor
Blood collection tubes containing sodium heparin BD 367871
BSA yisheng 36106es60 Fetal bovine serum
cAMP Sigma-Aldrich D0627 Dibutyryladenosine cyclic monophosphate
CellBanker 2 ZENOAQ 100ml Used as freezing medium for PBMNCs
Chemically defined lipid concentrate Invitrogen 11905031
CHIR99021 Gene Operation 04-0004
Coverslip Fisher 25*25-2
DAPI Sigma-Aldrich D8417-10mg
DAPT Sigma-Aldrich D5942
Dexamethasone Sigma-Aldrich D2915-100MG
DMEM-F12 Gibco 11330
DMEM-F12 Gibco 11320
Donkey serum Jackson 017-000-121
EPO Peprotech 100-64-50UG Human Erythropoietin
FGF8b Peprotech 100-25
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-02 P=1.077, density gradient medium
GDNF Peprotech 450-10 Glial derived neurotrophic factor
GlutaMAX Invitrogen 21051024 100 × Glutamine stock solution
Ham's-F12 Gibco 11765-054
HBSS Invitrogen 14175079 Balanced salt solution
Human leukemia inhibitory factor Millpore LIF1010
Human recombinant SCF Peprotech 300-07-100UG
IGF-1 Peprotech 100-11-100UG Human insulin-like growth factor 
IL-3 Peprotech 200-03-10UG Human interleukin 3
IMDM Gibco 215056-023 Iscove's modified Dulbecco's medium
Insulin Roche  12585014
ITS-X Invitrogen 51500-056 Insulin-transferrin-selenium-X supplement
Knockout serum replacement Gibco 10828028 Serum free basal medium
Laminin Roche  11243217001
Microsyringe Hamilton 7653-01
N2 supplement  Invitrogen 17502048
NEAA Invitrogen 11140050 Non-essential amino acid
Neurobasal Gibco 10888 Basic medium
PDL Sigma-Aldrich P7280 Poly-D-lysine
SAG1 Enzo ALX-270-426-M01
SB431542 Gene Operation 04-0010-10mg Store from light at -20℃
Sendai virus Life Technologies MAN0009378
Sucrose baiaoshengke
TGFβⅢ Peprotech 100-36E Transforming growth factor  βⅢ
Transferrin R&D Systems 2914-HT-100G
Triton X 100 baiaoshengke Nonionic surfactant
Trypan blue Gibco T10282
Xylazine Sigma-Aldrich X1126

References

  1. Williams-Gray, C. H., et al. The distinct cognitive syndromes of Parkinson’s disease: 5 year follow-up of the CamPaIGN cohort. Brain. 132, 2958-2969 (2009).
  2. Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radical Biology and Medicine. 62, 132-144 (2013).
  3. Chen, Z. Cell Therapy for Parkinson’s Disease: New Hope from Reprogramming Technologies. Aging and Disease. 6 (6), 499-503 (2015).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  5. Doi, D., et al. Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
  6. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
  7. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12543-12548 (2004).
  8. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson’s disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  9. Ma, T., Xie, M., Laurent, T., Ding, S. Progress in the reprogramming of somatic cells. Circulation Research. 112 (3), 562-574 (2013).
  10. Tang, X., et al. Conversion of adult human peripheral blood mononuclear cells into induced neural stem cell by using episomal vectors. Stem Cell Research. 16 (2), 236-242 (2016).
  11. Yuan, Y., et al. Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson’s disease model. Theranostics. 8 (17), 4679-4694 (2018).
  12. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  13. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  14. Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
  15. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  16. Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nature Protocols. 7 (4), 718-728 (2012).
  17. Bazley, F. A., et al. Direct Reprogramming of Human Primordial Germ Cells into Induced Pluripotent Stem Cells: Efficient Generation of Genetically Engineered Germ Cells. Stem Cells and Development. 24 (22), 2634-2648 (2015).
  18. Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. Journal of Virology. 74 (14), 6564-6569 (2000).
  19. Sochacki, J., Devalle, S., Reis, M., Mattos, P., Rehen, S. Generation of urine iPS cell lines from patients with Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) using a non-integrative method. Stem Cell Research. 17 (1), 102-106 (2016).
  20. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14234-14239 (2011).
  21. Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3392-3397 (2008).
  22. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. -. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7 (11), 2013-2021 (2012).
  23. Zhu, S., et al. Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds. Cell Stem Cell. 7 (6), 651-655 (2010).
  24. Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
  25. Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1 (6), 703-714 (2012).
  26. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  27. Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (4), 336-347 (2010).
  28. Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson’s disease. Acta Neurochirurgica Supplements. 101, 89-92 (2008).
  29. Sheng, C., et al. Generation of dopaminergic neurons directly from mouse fibroblasts and fibroblast-derived neural progenitors. Cell Research. 22 (4), 769-772 (2012).
  30. Prasad, A., et al. A review of induced pluripotent stem cell, direct conversion by trans-differentiation, direct reprogramming and oligodendrocyte differentiation. Regenerative Medicine. 11 (2), 181-191 (2016).

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Cite This Article
Zheng, W., Chen, Z. Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies. J. Vis. Exp. (149), e59690, doi:10.3791/59690 (2019).

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