Summary

Изоляция и количественная оценка вируса Зика из нескольких органов в мыши

Published: August 15, 2019
doi:

Summary

Цель протокола состоит в том, чтобы продемонстрировать методы, используемые для исследования вирусных заболеваний путем изоляции и количественной оценки вируса Зика, от нескольких органов в мыши после инфекции.

Abstract

Представленные методы демонстрируют лабораторные процедуры для изоляции органов от инфицированных вирусом Зика животных и количественную оценку вирусной нагрузки. Целью процедуры является количественная оценка вирусных титрав в периферических и ЦНС областях мыши в разных точках времени после инфекции или в различных экспериментальных условиях для выявления вирусологических и иммунологических факторов, которые регулируют вирусную инфекцию зика. Продемонстрированные процедуры изоляции органов позволяют как формировать фокус-формировать количественную оценку, так и количественную оценку ПЦР вирусных титров. Методы быстрой изоляции органов предназначены для сохранения вируса титра. Вирусная количественная оценка титра путем проведения спомощьи фокус-формирования позволяет быстро оценить пропускную стоимость вируса Зика. Преимуществом фокусобразующего ассса является оценка инфекционного вируса, ограничение этого анализа является потенциалом токсичности органов, уменьшающей предел обнаружения. Вирусная оценка титра сочетается с количественным ПЦР, а с помощью рекомбинантного РНК-копировальный контроль вирусного генома в органе оценивается с низким пределом обнаружения. В целом эти методы обеспечивают точный быстрый метод высокой пропускной связи для анализа вирусных титеров Зика на периферии и ЦНС инфицированных животных вирусом Зика и могут быть применены для оценки вирусных титр в органах животных, инфицированных большинством патогенных микроорганизмов, включая вирус Денге.

Introduction

Вирус Зика (ЗИКВ) является арбовирус, который принадлежит к семейство flaviviridae, который включает в себя важные нейроинвазивные человеческие патогены, такие как вирус Powassan (POWV), японский вирус энцефалита (JEV), и вирус Западного Нила (WNV)1. После его изоляции и идентификации, периодически поступают сообщения оинфекциях, инфекциях, инфицированных людьми в Африке и Азии 2,3,4,5,и эпидемиях в Центральной и ссылка6). Тем не менее, он не был до недавнего времени, что ЗИКВ считалось причиной тяжелой болезни7. В настоящее время существуют тысячи случаев неврологических заболеваний и врожденных дефектов, связанных с инфекциями ЗИКВ. Быстрое появление ЗИКВ вызвало много вопросов, связанных с: почему наблюдается увеличение тяжести заболевания, какова иммунологическая реакция на инфекцию ЗИКВ и существуют вирусные и/или иммунные опосредованные патологии, связанные с увеличением неврологических проявления и врожденные дефекты. В настоящее время существует спешка, чтобы понять, центральной нервной системы (ЦНС), связанных с болезнью, связанной с ЗИКВ, а также необходимость быстрого тестирования эффективности противовирусных препаратов и вакцин против ЗИКВ. Именно на этом фоне мы разработали методы быстрого анализа титров ЗИКВ как на периферии, так и в ЦНС с использованием анализа фокус-образующих фокусов (FFA) с помощью анализа, формирующего фокусы ,IKV).

Малые модели животных важны для понимания прогрессирования заболевания и для ранней оценки вакцин, терапевтических препаратов и противовирусных препаратов. Мы создали небольшие модели животных для изучения арбовирусной болезни с помощью различных штаммов мыши для моделирования инфекции человека и защиты от вирусных патогенов8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Используя этот предыдущий опыт, мы начали изменять методы, используемые для оценки WNV и денге вирус, связанный флавивирус для оценки ЗИКВ титер в обоих периферических органов, а также ЦНС21,23, 24. Преимущества этих методов по сравнению с другими анализами: 1) что они сочетают в себе способность собирать как периферийные, так и cnS органов для анализа; 2) методы адаптируются для цитометрии потока, для измерения врожденных и адаптивных иммунных реакций, наряду с вирусными титерами на одном животном в том же органе; 3) техника сбора урожая адаптируется для гистологического анализа; 4) FFA зиКВ является быстрым методом высокой пропускной их возможности для анализа вирусного титра; и 5) эти методы могут быть применены для оценки вирусных титр в органах животных, инфицированных большинством патогенов25.

Protocol

Все процедуры настоящего исследования соответствуют руководящим принципам, установленным Комитетом по уходу и использованию животных Университета Сент-Луиса. SLU полностью аккредитованАссоциацией Ассоциации по оценке и аккредитации Организации По уходу за животными International (AAALAC). <…

Representative Results

Для оценки титеров ЗИКВ с помощью протокола, описанного выше Ifnar1-/- мыши были инфицированы ЗИКВ (PRVABC59) с помощью подкожной (SC) инъекции в подножку. Здесь, администрация 1 х 105 FFU из ЗИКВ до 8-12 недель Ifnar1-/- мышей SC не является смертельным, но вирус ?…

Discussion

Инфекция ЗИКВ может вызвать неврологическое заболевание, поэтому нынешние модели животных для изучения патогенеза, иммунных реакций и защитной эффективности вакцин и противовирусных препаратов должны сосредоточиться на вирусном контроле в рамках ЦНС. Одна из проблем в фокусировке н…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Д-р Пинто финансируется за счет семенного гранта от Университета Сент-Луиса школы медицины и запуска средств из Университета Сент-Луиса школы медицины. Д-р Бриен финансируется K22AI104794 раннего следователя награду от NIH NIAID, а также семян грант от школы Университета Сент-Луиса. Для всех финансируемых лиц спонсоры не имели никакой роли в разработке, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Materials

1-bromo-3-chloropropane (BCP) MRC gene BP151
10cc syringe Thermo Fisher Scientific BD 309642
18G needle Thermo Fisher Scientific 22-557-145
1cc TB syringe Thermo Fisher Scientific 14-823-16H
20cc syringe Thermo Fisher Scientific 05-561-66
24 tube beadmill Thermo Fisher Scientific 15 340 163
3.2 mm stainless steel beads Thermo Fisher Scientific NC9084634
37C Tissue Culture incubator Nuair 5800
4G2 antibody in house
96 well flat bottom plates Midsci TP92696
96well round bottom plates Midsci TP92697
Basix 1.5ml eppendorf tubes Thermo Fisher Scientific 02-682-002
Concentrated Germicidal Bleach Staples 30966CT
CTL S6 Analyzer CTL CTL S6 Universal Analyzer
curved cutting scissors Fine Science Tools 14061-11
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose With 4500 mg/L glucose MilliporeSigma D5671
Ethanol (molecular biology-grade) MilliporeSigma e7023
Fetal Bovine Serum MilliporeSigma F0926-500ML
Forceps Fine Science Tools 11036-20
Glacial acetic acid MilliporeSigma 537020
Goat anti-mouse HRP-labeled antibody MilliporeSigma 8924
HEPES 1 M MilliporeSigma H3537-100ML
Isopropanol (molecular biology-grade) MilliporeSigma I9516
Ketamine/Xylazine cocktail Comparative Medicine
L-glutamine MilliporeSigma g7513
Magmax RNA purification kit Thermo Fisher Scientific AM1830
Methylcellulose MilliporeSigma M0512
Microcentrifuge Ependorf 5424R
MiniCollect 0.5ml EDTA tubes Bio-one 450480
o-ring tubes Thermo Fisher Scientific 21-403-195
one step q RT-PCR mix Thermo Fisher Scientific 4392938
Paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific EMS- 15713-S
Phosphate Buffered Saline MilliporeSigma d8537-500ml
Proline multichannel pipettes Sartorius 72230/72240
Proline single channel pipettes Sartorius 728230
RNAse free water Thermo Fisher Scientific 10-977-023
RNAzol BD MRC gene RB192
Rocking Platform Thermo Fisher Scientific 11-676-333
RPMI 1640 Fisher MT10040CV
Saponin MilliporeSigma s7900
spoon/spatula Fine Science Tools 10090-17
straight cutting scissors Fine Science Tools 14060-11
Triton X-100 MilliporeSigma t8787
True Blue Substrate VWR 95059-168
Trypsin MilliporeSigma T3924-100ML

References

  1. Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
  2. Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
  3. Fagbami, A. Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria. Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).
  4. McCrae, A. W., Kirya, B. G. Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).
  5. Rodhain, F., et al. Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).
  6. Wikan, N., Smith, D. R. Zika virus: history of a newly emerging arbovirus. Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).
  7. . Zika virus outbreaks in the Americas. The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).
  8. Brien, J. D. . Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , (2007).
  9. Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection. Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).
  10. Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).
  11. Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
  12. Shrestha, B., et al. The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1. PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).
  13. Brien, J. D., et al. Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).
  14. Pinto, A. K., et al. A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).
  15. Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).
  16. Brien, J. D., et al. Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus. Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).
  17. Messaoudi, I., et al. Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).
  18. Pinto, A. K., et al. A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice. Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).
  19. Sukupolvi-Petty, S., et al. Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection. Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).
  20. Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).
  21. Pinto, A. K., et al. Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection. MBio. 6 (5), (2015).
  22. Pinto, A. K., et al. Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families. Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).
  23. Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).
  24. Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).
  25. Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).
  26. Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).
  27. Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection. Virology. 412 (1), 101-109 (2011).
  28. Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice. Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).

Play Video

Cite This Article
Brien, J. D., Hassert, M., Stone, E. T., Geerling, E., Cruz-Orengo, L., Pinto, A. K. Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse. J. Vis. Exp. (150), e59632, doi:10.3791/59632 (2019).

View Video