Aislamiento y cuantificación del virus del Zika de múltiples órganos en un ratón
Summary
El objetivo del protocolo es demostrar las técnicas utilizadas para investigar la enfermedad viral aislándose y cuantificando el virus del Zika, a partir de múltiples órganos en un ratón después de la infección.
Abstract
Los métodos que se presentan demuestran procedimientos de laboratorio para el aislamiento de órganos de animales infectados por el virus del Zika y la cuantificación de la carga viral. El objetivo del procedimiento es cuantificar los lanzadores virales en áreas periféricas y del SNC del ratón en diferentes momentos posteriores a la infección o en diferentes condiciones experimentales para identificar factores virológicos e inmunológicos que regulan la infección por el virus del Zika. Los procedimientos de aislamiento de órganos demostrados permiten tanto la cuantificación del ensayo de formación de enfoque como la evaluación cuantitativa de la PCR de los lanzadores virales. Las técnicas de aislamiento rápido de órganos están diseñadas para la preservación del morte del virus. La cuantificación de los titer virales mediante el ensayo de formación de enfoque permite la evaluación rápida del rendimiento del virus del Zika. El beneficio del ensayo de formación de enfoque es la evaluación del virus infeccioso, la limitación de este ensayo es el potencial de toxicidad de órganos que reduce el límite de detección. La evaluación del titor viral se combina con un PCR cuantitativo, y el uso de un número de copia del genoma viral de control de ARN recombinante dentro del órgano se evalúa con un límite bajo de detección. En general, estas técnicas proporcionan un método preciso de alto rendimiento rápido para el análisis de los lanzadores virales del Zika en la periferia y el SNC de los animales infectados por el virus del Zika y se pueden aplicar a la evaluación de los tituladores virales en los órganos de los animales infectados con la mayoría de los animales infectados con la mayoría patógenos, incluido el virus del dengue.
Introduction
El virus del Zika (ZIKV) es un arbovirus que pertenece a la familia flaviviridae, que incluye importantes patógenos humanos neuroinvasivos como el virus powassan (POWV), el virus de la encefalitis japonesa (VJE) y el virus del Nilo Occidental (WNV)1. Tras su aislamiento e identificación, se han notificado periódicamentelas infecciones humanas por el ZIKV en Africa y Asia 2,3,4,5, y epidemias en América Central y del Sur (revisado sin referencia6). Sin embargo, no fue hasta hace pocoque se pensaba que ZIKV causaba una enfermedad grave 7. Ahora hay miles de casos de enfermedades neurológicas y defectos congénitos relacionados con infecciones por ZIKV. La rápida aparición de ZIKV ha suscitado muchas preguntas relacionadas con: por qué hay un aumento en la gravedad de la enfermedad, cuál es la respuesta inmunológica a la infección por ZIKV y existen patologías virales y/o inmunes mediadas relacionadas con el aumento de la neurología manifestaciones y defectos congénitos. Ahora existe la prisa por entender la enfermedad relacionada con el sistema nervioso central (SNC) asociada con el ZIKV, así como la necesidad de probar rápidamente la eficacia de los antivirales y vacunas contra el ZIKV. Es en este contexto que hemos desarrollado métodos para el análisis rápido de los titulas ZIKV tanto en la periferia como en el SNC utilizando un enfoque específico de ZIKV (FFA).
Los modelos animales pequeños son importantes para comprender la progresión de la enfermedad y para la evaluación temprana de vacunas, terapias y antivirales. Hemos establecido pequeños modelos animales para el estudio de la enfermedad de arbovirus mediante el uso de varias cepas de ratón para modelar la infección humana y la protección contra patógenos virales8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Utilizando esta experiencia previa, comenzamos a modificar las técnicas utilizadas para la evaluación del virus WNV y del dengue, un flavivirus relacionado para la evaluación del titer ZIKV tanto en órganos periféricos como en el SNC21,23, 24. Las ventajas de estos métodos sobre otros ensayos son: 1) que combinen la capacidad de cosechar órganos periféricos y del SNC para el análisis; 2) los métodos son adaptables para la citometría de flujo, para mediciones de respuestas inmunitarias innatas y adaptativas, junto con tituladores virales en el mismo animal en el mismo órgano; 3) la técnica de cosecha es adaptable para el análisis histológico; 4) el ZIKV FFA es un método de alto rendimiento rápido para el análisis de titer viral; y 5) estos métodos pueden aplicarse a la evaluación de tituladores virales en los órganos de animales infectados con la mayoría de los patógenos25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Por lo tanto, la infección por ZIKV puede causar una enfermedad neurológica, por lo que los modelos animales actuales para estudiar la patogénesis, las respuestas inmunitarias y la eficacia protectora de las vacunas y los antivirales deben centrarse en el control viral dentro del SNC. Uno de los desafíos para centrarse en la enfermedad del SNC es que a menudo viene a expensas de estudiar la infección periférica. Los métodos de aislamiento de órganos propuestos aquí se centran en la necesidad de evaluar rápidame…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El Dr. Pinto es financiado por una beca de semilla de la Escuela de Medicina de la Universidad de Saint Louis y fondos de startups de la Escuela de Medicina de la Universidad de Saint Louis. El Dr. Brien es financiado por un premio K22AI104794 de investigador temprano de la NIH NIAID, así como una beca de semilla de la Escuela de la Universidad de Saint Louis. Para todas las personas financiadas, los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.
Materials
| 1-bromo-3-chloropropane (BCP) | MRC gene | BP151 | |
| 10cc syringe | Thermo Fisher Scientific | BD 309642 | |
| 18G needle | Thermo Fisher Scientific | 22-557-145 | |
| 1cc TB syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-823-16H | |
| 20cc syringe | Thermo Fisher Scientific | 05-561-66 | |
| 24 tube beadmill | Thermo Fisher Scientific | 15 340 163 | |
| 3.2 mm stainless steel beads | Thermo Fisher Scientific | NC9084634 | |
| 37C Tissue Culture incubator | Nuair | 5800 | |
| 4G2 antibody | in house | ||
| 96 well flat bottom plates | Midsci | TP92696 | |
| 96well round bottom plates | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5ml eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | |
| Concentrated Germicidal Bleach | Staples | 30966CT | |
| CTL S6 Analyzer | CTL | CTL S6 Universal Analyzer | |
| curved cutting scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose With 4500 mg/L glucose | MilliporeSigma | D5671 | |
| Ethanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | e7023 | |
| Fetal Bovine Serum | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11036-20 | |
| Glacial acetic acid | MilliporeSigma | 537020 | |
| Goat anti-mouse HRP-labeled antibody | MilliporeSigma | 8924 | |
| HEPES 1 M | MilliporeSigma | H3537-100ML | |
| Isopropanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | I9516 | |
| Ketamine/Xylazine cocktail | Comparative Medicine | ||
| L-glutamine | MilliporeSigma | g7513 | |
| Magmax RNA purification kit | Thermo Fisher Scientific | AM1830 | |
| Methylcellulose | MilliporeSigma | M0512 | |
| Microcentrifuge | Ependorf | 5424R | |
| MiniCollect 0.5ml EDTA tubes | Bio-one | 450480 | |
| o-ring tubes | Thermo Fisher Scientific | 21-403-195 | |
| one step q RT-PCR mix | Thermo Fisher Scientific | 4392938 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | EMS- 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | d8537-500ml | |
| Proline multichannel pipettes | Sartorius | 72230/72240 | |
| Proline single channel pipettes | Sartorius | 728230 | |
| RNAse free water | Thermo Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC gene | RB192 | |
| Rocking Platform | Thermo Fisher Scientific | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | Fisher | MT10040CV | |
| Saponin | MilliporeSigma | s7900 | |
| spoon/spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| straight cutting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | t8787 | |
| True Blue Substrate | VWR | 95059-168 | |
| Trypsin | MilliporeSigma | T3924-100ML |
References
- Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
- Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
- Fagbami, A. Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria. Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).
- McCrae, A. W., Kirya, B. G. Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).
- Rodhain, F., et al. Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).
- Wikan, N., Smith, D. R. Zika virus: history of a newly emerging arbovirus. Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).
- . Zika virus outbreaks in the Americas. The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).
- Brien, J. D. . Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , (2007).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection. Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Shrestha, B., et al. The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1. PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).
- Brien, J. D., et al. Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).
- Pinto, A. K., et al. A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).
- Brien, J. D., et al. Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus. Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).
- Messaoudi, I., et al. Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).
- Pinto, A. K., et al. A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice. Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).
- Sukupolvi-Petty, S., et al. Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection. Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).
- Pinto, A. K., et al. Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection. MBio. 6 (5), (2015).
- Pinto, A. K., et al. Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families. Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).
- Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection. Virology. 412 (1), 101-109 (2011).
- Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice. Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).
