Isolamento e quantificazione del virus zika da più organi in un mouse
Summary
L’obiettivo del protocollo è quello di dimostrare le tecniche utilizzate per studiare la malattia virale isolando e quantificando il virus zoika, da più organi in un topo dopo l’infezione.
Abstract
I metodi presentati dimostrano le procedure di laboratorio per l’isolamento degli organi dagli animali infetti dal virus zika e la quantificazione del carico virale. Lo scopo della procedura è quello di quantificare i dispositivi virali nelle aree periferiche e del SNC del topo in diversi momenti dopo l’infezione o in diverse condizioni sperimentali per identificare i fattori virologici e immunologici che regolano l’infezione da virus zika. Le procedure di isolamento degli organi dimostrate consentono sia la quantificazione del saggio che la valutazione quantitativa della PCR dei titer virali. Le tecniche di isolamento rapido degli organi sono progettate per la conservazione del titro del virus. La quantificazione del titro virale per messa a fuoco formando il saggio consente la rapida valutazione della produttività del virus . Il vantaggio della formazione di analisi di fuoco è la valutazione del virus infettivo, la limitazione di questo saggio è il potenziale per la tossicità degli organi riducendo il limite di rilevamento. La valutazione del titro virale è combinata con la PCR quantitativa e l’utilizzo di un numero di copia virale del genoma del controllo dell’RNA ricombinante all’interno dell’organo viene valutato con un basso limite di rilevamento. Nel complesso, queste tecniche forniscono un metodo rapido ed accurato ad alto throughput rapido per l’analisi dei titoli virali di zika nella periferia e del SNC degli animali infetti del virus zika e possono essere applicati alla valutazione dei titoli virali negli organi degli animali infetti con la maggior parte agenti patogeni, tra cui il virus Dengue.
Introduction
Il virus del virus zika è un arbovirus appartenente alla famiglia flaviviridae, che comprende importanti patogeni umani neuroinvasivi come il virus Powassan (POWV), il virus dell’encefalite giapponese (JEV) e il virus del Nilo occidentale (WNV)1. A seguito del suo isolamento e della sua identificazione, sonostati periodici rapporti periodici di infezioni umane in Africa e Asia 2,3,4,5,ed epidemie all’interno dell’America centrale e meridionale (riviste in riferimento6). Tuttavia, non è stato fino a poco tempo fa che si pensava che la Malattia di IKV causasse una grave malattia7. Ora ci sono migliaia di casi di malattie neurologiche e difetti alla nascita legati alle infezioni da .IKV. La rapida comparsa dello ZiKV ha suscitato molte domande relative al: perché c’è un aumento della gravità della malattia, qual è la risposta immunologica all’infezione da manifestazioni e difetti alla nascita. Ora c’è fretta di comprendere la malattia correlata al sistema nervoso centrale (SNC) associata all’IKV, nonché la necessità di testare rapidamente l’efficacia degli antivirali e dei vaccini contro la . È in questo contesto che abbiamo sviluppato metodi per l’analisi rapida dei titoli di iKV sia nella periferia che nel CNS utilizzando un’attenzione specifica per la .IKV (FFA).
I modelli animali di piccole dimensioni sono importanti per comprendere la progressione della malattia e per la valutazione precoce di vaccini, terapie e anti-virali. Abbiamo stabilito piccoli modelli animali per lo studio della malattia da arbovirus utilizzando vari ceppi murini per modellare l’infezione umana e la protezione contro i patogeni virali8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Utilizzando questa precedente esperienza, abbiamo iniziato a modificare le tecniche utilizzate per la valutazione del virus WNV e Dengue, un flavivirus correlato per la valutazione del titro di . 24. I vantaggi di questi metodi rispetto ad altri saggi sono: 1) che essi combinano la capacità di raccogliere sia organi periferici che sNC per l’analisi; 2) i metodi sono adattabili per la citometria di flusso, per le misurazioni di risposte immunitarie innate e adattative, insieme a i titori virali sullo stesso animale nello stesso organo; 3) la tecnica del raccolto è adattabile per l’analisi istologica; 4) l’IKV FFA è un metodo rapido ad alta produttività per l’analisi del titro virale; e 5) questi metodi possono essere applicati alla valutazione dei titori virali negli organi degli animali infettati con la maggior parte degli agenti patogeni25.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’infezione da IKV può causare una malattia neurologica, quindi gli attuali modelli animali per studiare la patogenesi, le risposte immunitarie e l’efficacia protettiva dei vaccini e degli antivirali devono concentrarsi sul controllo virale all’interno del SNC. Una delle sfide nel concentrarsi sulla malattia del SNC è che spesso va a scapito dello studio dell’infezione periferica. I metodi di isolamento dell’organo qui proposti si concentrano sulla necessità di valutare rapidamente l’infezione da IKV sia nella perifer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Pinto è finanziato da una sovvenzione di seme della Saint Louis University School of Medicine e fondi di avvio dalla Saint Louis University School of Medicine. Il Dr. Brien è finanziato da un K22AI104794 premio ricercatore precoce dal NIH NIAID e una sovvenzione di seme dalla Saint Louis University School. Per tutte le persone finanziate, i finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell’analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.
Materials
| 1-bromo-3-chloropropane (BCP) | MRC gene | BP151 | |
| 10cc syringe | Thermo Fisher Scientific | BD 309642 | |
| 18G needle | Thermo Fisher Scientific | 22-557-145 | |
| 1cc TB syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-823-16H | |
| 20cc syringe | Thermo Fisher Scientific | 05-561-66 | |
| 24 tube beadmill | Thermo Fisher Scientific | 15 340 163 | |
| 3.2 mm stainless steel beads | Thermo Fisher Scientific | NC9084634 | |
| 37C Tissue Culture incubator | Nuair | 5800 | |
| 4G2 antibody | in house | ||
| 96 well flat bottom plates | Midsci | TP92696 | |
| 96well round bottom plates | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5ml eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | |
| Concentrated Germicidal Bleach | Staples | 30966CT | |
| CTL S6 Analyzer | CTL | CTL S6 Universal Analyzer | |
| curved cutting scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose With 4500 mg/L glucose | MilliporeSigma | D5671 | |
| Ethanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | e7023 | |
| Fetal Bovine Serum | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11036-20 | |
| Glacial acetic acid | MilliporeSigma | 537020 | |
| Goat anti-mouse HRP-labeled antibody | MilliporeSigma | 8924 | |
| HEPES 1 M | MilliporeSigma | H3537-100ML | |
| Isopropanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | I9516 | |
| Ketamine/Xylazine cocktail | Comparative Medicine | ||
| L-glutamine | MilliporeSigma | g7513 | |
| Magmax RNA purification kit | Thermo Fisher Scientific | AM1830 | |
| Methylcellulose | MilliporeSigma | M0512 | |
| Microcentrifuge | Ependorf | 5424R | |
| MiniCollect 0.5ml EDTA tubes | Bio-one | 450480 | |
| o-ring tubes | Thermo Fisher Scientific | 21-403-195 | |
| one step q RT-PCR mix | Thermo Fisher Scientific | 4392938 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | EMS- 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | d8537-500ml | |
| Proline multichannel pipettes | Sartorius | 72230/72240 | |
| Proline single channel pipettes | Sartorius | 728230 | |
| RNAse free water | Thermo Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC gene | RB192 | |
| Rocking Platform | Thermo Fisher Scientific | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | Fisher | MT10040CV | |
| Saponin | MilliporeSigma | s7900 | |
| spoon/spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| straight cutting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | t8787 | |
| True Blue Substrate | VWR | 95059-168 | |
| Trypsin | MilliporeSigma | T3924-100ML |
References
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