Summary

Isolamento e quantificação do vírus Zika de múltiplos órgãos em um mouse

Published: August 15, 2019
doi:

Summary

O objetivo do protocolo é demonstrar as técnicas utilizadas para investigar a doença viral, isolando e quantificando o vírus Zika, de múltiplos órgãos em um camundongo após a infecção.

Abstract

Os métodos apresentados demonstram procedimentos laboratoriais para o isolamento de órgãos de animais infectados pelo vírus Zika e a quantificação da carga viral. O objetivo do procedimento é quantificar os títulos virais em áreas periféricas e do SNC do camundongo em diferentes pontos temporais pós-infecção ou diferentes condições experimentais para identificar fatores virológicos e imunológicos que regulam a infecção pelo vírus Zika. Os procedimentos da isolação do órgão demonstraram permitem a quantificação do ensaio da formação do foco e a avaliação quantitativa do PCR de Titers virais. As técnicas rápidas da isolação do órgão são projetadas para a preservação do Titer do vírus. A quantificação do Titer viral pelo ensaio de conformação de foco permite a avaliação rápida da taxa de transferência do vírus Zika. O benefício do ensaio de formação de foco é a avaliação do vírus infeccioso, a limitação deste ensaio é o potencial para toxicidade de órgãos reduzindo o limite de detecção. A avaliação do Titer viral é combinada com o PCR quantitativo, e usar um número de cópia do genoma viral do controle da cópia do RNA recombinante dentro do órgão é avaliado com baixo limite de deteção. No geral, essas técnicas fornecem um método de alta taxa de transferência rápida e precisa para a análise dos títulos virais da Zika na periferia e no SNC dos animais infectados pelo vírus Zika e podem ser aplicados à avaliação de títulos virais nos órgãos de animais infectados com a maioria dos patogénicos, incluindo o vírus da dengue.

Introduction

O vírus Zika (ZIKV) é um arbovírus pertencente à família Flaviviridae, que inclui importantes patógenos humanos neuroinvasivos, como o vírus Powassan (POWV), o vírus da encefalite japonesa (JEV) e o vírus do Nilo Ocidental (WNV)1. Após seu isolamento e identificação, houve relatos periódicos de infecções humanas de zikv na África e na Ásia2,3,4,5e epidemias dentro da América Central e do Sul (revisada em referência6). Entretanto, não era até recentemente que o ZIKV estêve pensado para causar a doença severa7. Agora há milhares de casos de doença neurológica e defeitos congênitos ligados a infecções por ZIKV. A rápida emergência do ZIKV tem alertado para muitas questões relacionadas com: por que há um aumento na severidade da doença, qual é a resposta imunológica à infecção por ZIKV e existem patologias virais e/ou imunes mediadas ligadas ao aumento da manifestações e defeitos congênitos. Há agora uma pressa para compreender a doença relacionada do sistema nervoso central (CNS) associada com o ZIKV assim como a necessidade de testar ràpida a eficácia dos antivirais e das vacinas de encontro a ZIKV. É contra este pano de fundo que desenvolvemos métodos para a rápida análise dos títulos de ZIKV tanto na periferia como no SNC, utilizando um foco específico de ZIKV formando ensaios (FFA).

Os modelos animais pequenos são importantes para compreender a progressão da doença e para a avaliação adiantada das vacinas, da terapêutica, e dos anti-Virals. Nós estabelecemos modelos animais pequenos para o estudo da doença do arbovírus usando várias tensões do rato para modelar a infecção humana e a proteção de encontro aos micróbios patogénicos virais8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Usando essa experiência prévia, começamos a modificar as técnicas utilizadas para a avaliação do vírus da WNV e da dengue, um Flavivirus relacionado para a avaliação do titer de zikv em ambos os órgãos periféricos, bem como o SNC21,23, as vantagens 24. The destes métodos sobre outros ensaios são: 1) que combinam a habilidade de colher órgãos periféricos e do CNS para a análise; 2) os métodos são adaptáveis para a citometria de fluxo, para medições de respostas imunes inatas e adaptativas, juntamente com títulos virais no mesmo animal no mesmo órgão; 3) a técnica de colheita é adaptável para análise histológica; 4) o ZIKV FFA é um método rápido da taxa de transferência elevada para a análise viral do Titer; e 5) esses métodos podem ser aplicados à avaliação de títulos virais nos órgãos de animais infectados com a maioria dos patógenos25.

Protocol

Todos os procedimentos do presente estudo estão de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê de cuidados e uso de animais da Universidade de St. Louis. A SLU é totalmente credenciada pela Associação de avaliação e credenciamento do laboratório de cuidados com animais internacionais (AAALAC). 1. isolamento de órgãos Nota: O vírus não é estável à temperatura ambiente (RT), de modo que o número de animais colhidos ao mesmo tempo …

Representative Results

Para avaliar títulos de zikv usando o protocolo descrito acima Ifnar1-/- os ratos foram contaminados com o zikv (PRVABC59) através da injeção subcutaneous (SC) ao footpad. Aqui, a administração de 1 x 105 FFU de zikv para 8-12 semana de idade Ifnar1-/- MICE SC não é letal, mas o vírus pode replicar na periferia e CNS. Esta dose e rota são usadas para estudar as respostas imunes do patógeno hospedeiro e a patogenicidade. Admini…

Discussion

A infecção por ZIKV pode causar uma doença neurológica, portanto, os modelos animais atuais para estudar a patogênese, respostas imunes e eficácia protetora de vacinas e antivirais precisam se concentrar no controle viral dentro do SNC. Um dos desafios em focar na doença do SNC é que muitas vezes vem à custa de estudar a infecção periférica. Os métodos de isolamento de órgãos propostos aqui se centram na necessidade de avaliar rapidamente a infecção pelo ZIKV tanto na periferia quanto no SNC, a fim de av…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O Dr. pinto é financiado por uma bolsa de sementes da faculdade de medicina da Universidade de Saint Louis e fundos de arranque da faculdade de medicina da Universidade de Saint Louis. O Dr. Brien é financiado por um K22AI104794 prêmio de investigador precoce do NIH NIAID, bem como uma concessão de sementes da escola Saint Louis University. Para todos os indivíduos financiados, os financiadores não tiveram papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Materials

1-bromo-3-chloropropane (BCP) MRC gene BP151
10cc syringe Thermo Fisher Scientific BD 309642
18G needle Thermo Fisher Scientific 22-557-145
1cc TB syringe Thermo Fisher Scientific 14-823-16H
20cc syringe Thermo Fisher Scientific 05-561-66
24 tube beadmill Thermo Fisher Scientific 15 340 163
3.2 mm stainless steel beads Thermo Fisher Scientific NC9084634
37C Tissue Culture incubator Nuair 5800
4G2 antibody in house
96 well flat bottom plates Midsci TP92696
96well round bottom plates Midsci TP92697
Basix 1.5ml eppendorf tubes Thermo Fisher Scientific 02-682-002
Concentrated Germicidal Bleach Staples 30966CT
CTL S6 Analyzer CTL CTL S6 Universal Analyzer
curved cutting scissors Fine Science Tools 14061-11
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose With 4500 mg/L glucose MilliporeSigma D5671
Ethanol (molecular biology-grade) MilliporeSigma e7023
Fetal Bovine Serum MilliporeSigma F0926-500ML
Forceps Fine Science Tools 11036-20
Glacial acetic acid MilliporeSigma 537020
Goat anti-mouse HRP-labeled antibody MilliporeSigma 8924
HEPES 1 M MilliporeSigma H3537-100ML
Isopropanol (molecular biology-grade) MilliporeSigma I9516
Ketamine/Xylazine cocktail Comparative Medicine
L-glutamine MilliporeSigma g7513
Magmax RNA purification kit Thermo Fisher Scientific AM1830
Methylcellulose MilliporeSigma M0512
Microcentrifuge Ependorf 5424R
MiniCollect 0.5ml EDTA tubes Bio-one 450480
o-ring tubes Thermo Fisher Scientific 21-403-195
one step q RT-PCR mix Thermo Fisher Scientific 4392938
Paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific EMS- 15713-S
Phosphate Buffered Saline MilliporeSigma d8537-500ml
Proline multichannel pipettes Sartorius 72230/72240
Proline single channel pipettes Sartorius 728230
RNAse free water Thermo Fisher Scientific 10-977-023
RNAzol BD MRC gene RB192
Rocking Platform Thermo Fisher Scientific 11-676-333
RPMI 1640 Fisher MT10040CV
Saponin MilliporeSigma s7900
spoon/spatula Fine Science Tools 10090-17
straight cutting scissors Fine Science Tools 14060-11
Triton X-100 MilliporeSigma t8787
True Blue Substrate VWR 95059-168
Trypsin MilliporeSigma T3924-100ML

References

  1. Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
  2. Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
  3. Fagbami, A. Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria. Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).
  4. McCrae, A. W., Kirya, B. G. Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).
  5. Rodhain, F., et al. Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).
  6. Wikan, N., Smith, D. R. Zika virus: history of a newly emerging arbovirus. Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).
  7. . Zika virus outbreaks in the Americas. The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).
  8. Brien, J. D. . Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , (2007).
  9. Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection. Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).
  10. Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).
  11. Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
  12. Shrestha, B., et al. The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1. PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).
  13. Brien, J. D., et al. Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).
  14. Pinto, A. K., et al. A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).
  15. Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).
  16. Brien, J. D., et al. Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus. Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).
  17. Messaoudi, I., et al. Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).
  18. Pinto, A. K., et al. A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice. Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).
  19. Sukupolvi-Petty, S., et al. Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection. Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).
  20. Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).
  21. Pinto, A. K., et al. Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection. MBio. 6 (5), (2015).
  22. Pinto, A. K., et al. Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families. Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).
  23. Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).
  24. Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).
  25. Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).
  26. Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).
  27. Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection. Virology. 412 (1), 101-109 (2011).
  28. Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice. Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).

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Cite This Article
Brien, J. D., Hassert, M., Stone, E. T., Geerling, E., Cruz-Orengo, L., Pinto, A. K. Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse. J. Vis. Exp. (150), e59632, doi:10.3791/59632 (2019).

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