Summary

Aislamiento y cuantificación del virus del Zika de múltiples órganos en un ratón

Published: August 15, 2019
doi:

Summary

El objetivo del protocolo es demostrar las técnicas utilizadas para investigar la enfermedad viral aislándose y cuantificando el virus del Zika, a partir de múltiples órganos en un ratón después de la infección.

Abstract

Los métodos que se presentan demuestran procedimientos de laboratorio para el aislamiento de órganos de animales infectados por el virus del Zika y la cuantificación de la carga viral. El objetivo del procedimiento es cuantificar los lanzadores virales en áreas periféricas y del SNC del ratón en diferentes momentos posteriores a la infección o en diferentes condiciones experimentales para identificar factores virológicos e inmunológicos que regulan la infección por el virus del Zika. Los procedimientos de aislamiento de órganos demostrados permiten tanto la cuantificación del ensayo de formación de enfoque como la evaluación cuantitativa de la PCR de los lanzadores virales. Las técnicas de aislamiento rápido de órganos están diseñadas para la preservación del morte del virus. La cuantificación de los titer virales mediante el ensayo de formación de enfoque permite la evaluación rápida del rendimiento del virus del Zika. El beneficio del ensayo de formación de enfoque es la evaluación del virus infeccioso, la limitación de este ensayo es el potencial de toxicidad de órganos que reduce el límite de detección. La evaluación del titor viral se combina con un PCR cuantitativo, y el uso de un número de copia del genoma viral de control de ARN recombinante dentro del órgano se evalúa con un límite bajo de detección. En general, estas técnicas proporcionan un método preciso de alto rendimiento rápido para el análisis de los lanzadores virales del Zika en la periferia y el SNC de los animales infectados por el virus del Zika y se pueden aplicar a la evaluación de los tituladores virales en los órganos de los animales infectados con la mayoría de los animales infectados con la mayoría patógenos, incluido el virus del dengue.

Introduction

El virus del Zika (ZIKV) es un arbovirus que pertenece a la familia flaviviridae, que incluye importantes patógenos humanos neuroinvasivos como el virus powassan (POWV), el virus de la encefalitis japonesa (VJE) y el virus del Nilo Occidental (WNV)1. Tras su aislamiento e identificación, se han notificado periódicamentelas infecciones humanas por el ZIKV en Africa y Asia 2,3,4,5, y epidemias en América Central y del Sur (revisado sin referencia6). Sin embargo, no fue hasta hace pocoque se pensaba que ZIKV causaba una enfermedad grave 7. Ahora hay miles de casos de enfermedades neurológicas y defectos congénitos relacionados con infecciones por ZIKV. La rápida aparición de ZIKV ha suscitado muchas preguntas relacionadas con: por qué hay un aumento en la gravedad de la enfermedad, cuál es la respuesta inmunológica a la infección por ZIKV y existen patologías virales y/o inmunes mediadas relacionadas con el aumento de la neurología manifestaciones y defectos congénitos. Ahora existe la prisa por entender la enfermedad relacionada con el sistema nervioso central (SNC) asociada con el ZIKV, así como la necesidad de probar rápidamente la eficacia de los antivirales y vacunas contra el ZIKV. Es en este contexto que hemos desarrollado métodos para el análisis rápido de los titulas ZIKV tanto en la periferia como en el SNC utilizando un enfoque específico de ZIKV (FFA).

Los modelos animales pequeños son importantes para comprender la progresión de la enfermedad y para la evaluación temprana de vacunas, terapias y antivirales. Hemos establecido pequeños modelos animales para el estudio de la enfermedad de arbovirus mediante el uso de varias cepas de ratón para modelar la infección humana y la protección contra patógenos virales8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Utilizando esta experiencia previa, comenzamos a modificar las técnicas utilizadas para la evaluación del virus WNV y del dengue, un flavivirus relacionado para la evaluación del titer ZIKV tanto en órganos periféricos como en el SNC21,23, 24. Las ventajas de estos métodos sobre otros ensayos son: 1) que combinen la capacidad de cosechar órganos periféricos y del SNC para el análisis; 2) los métodos son adaptables para la citometría de flujo, para mediciones de respuestas inmunitarias innatas y adaptativas, junto con tituladores virales en el mismo animal en el mismo órgano; 3) la técnica de cosecha es adaptable para el análisis histológico; 4) el ZIKV FFA es un método de alto rendimiento rápido para el análisis de titer viral; y 5) estos métodos pueden aplicarse a la evaluación de tituladores virales en los órganos de animales infectados con la mayoría de los patógenos25.

Protocol

Todos los procedimientos del presente estudio se ajustan a las directrices establecidas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de St. Louis. SLU está totalmente acreditada por la Asociación de Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International (AAALAC). 1. Aislamiento de órganos NOTA: El virus no es estable a temperatura ambiente (RT), por lo que el número de animales cosechados a la vez debe planificarse c…

Representative Results

Para evaluar los lanzadores ziKV utilizando el protocolo descrito anteriormente Ifnar1-/- ratones se infectaron con ZIKV (PRVABC59) mediante inyección subcutánea (SC) en la almohadilla del pie. Aquí, la administración de 1 x 105 FFU de ZIKV a 8-12 semanas de edad Ifnar1-/- ratones SC no es letal, pero el virus puede replicarse tanto en la periferia como en el SNC. Esta dosis y ruta se utilizan para estudiar las respuestas inmunitaria…

Discussion

Por lo tanto, la infección por ZIKV puede causar una enfermedad neurológica, por lo que los modelos animales actuales para estudiar la patogénesis, las respuestas inmunitarias y la eficacia protectora de las vacunas y los antivirales deben centrarse en el control viral dentro del SNC. Uno de los desafíos para centrarse en la enfermedad del SNC es que a menudo viene a expensas de estudiar la infección periférica. Los métodos de aislamiento de órganos propuestos aquí se centran en la necesidad de evaluar rápidame…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El Dr. Pinto es financiado por una beca de semilla de la Escuela de Medicina de la Universidad de Saint Louis y fondos de startups de la Escuela de Medicina de la Universidad de Saint Louis. El Dr. Brien es financiado por un premio K22AI104794 de investigador temprano de la NIH NIAID, así como una beca de semilla de la Escuela de la Universidad de Saint Louis. Para todas las personas financiadas, los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Materials

1-bromo-3-chloropropane (BCP) MRC gene BP151
10cc syringe Thermo Fisher Scientific BD 309642
18G needle Thermo Fisher Scientific 22-557-145
1cc TB syringe Thermo Fisher Scientific 14-823-16H
20cc syringe Thermo Fisher Scientific 05-561-66
24 tube beadmill Thermo Fisher Scientific 15 340 163
3.2 mm stainless steel beads Thermo Fisher Scientific NC9084634
37C Tissue Culture incubator Nuair 5800
4G2 antibody in house
96 well flat bottom plates Midsci TP92696
96well round bottom plates Midsci TP92697
Basix 1.5ml eppendorf tubes Thermo Fisher Scientific 02-682-002
Concentrated Germicidal Bleach Staples 30966CT
CTL S6 Analyzer CTL CTL S6 Universal Analyzer
curved cutting scissors Fine Science Tools 14061-11
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose With 4500 mg/L glucose MilliporeSigma D5671
Ethanol (molecular biology-grade) MilliporeSigma e7023
Fetal Bovine Serum MilliporeSigma F0926-500ML
Forceps Fine Science Tools 11036-20
Glacial acetic acid MilliporeSigma 537020
Goat anti-mouse HRP-labeled antibody MilliporeSigma 8924
HEPES 1 M MilliporeSigma H3537-100ML
Isopropanol (molecular biology-grade) MilliporeSigma I9516
Ketamine/Xylazine cocktail Comparative Medicine
L-glutamine MilliporeSigma g7513
Magmax RNA purification kit Thermo Fisher Scientific AM1830
Methylcellulose MilliporeSigma M0512
Microcentrifuge Ependorf 5424R
MiniCollect 0.5ml EDTA tubes Bio-one 450480
o-ring tubes Thermo Fisher Scientific 21-403-195
one step q RT-PCR mix Thermo Fisher Scientific 4392938
Paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific EMS- 15713-S
Phosphate Buffered Saline MilliporeSigma d8537-500ml
Proline multichannel pipettes Sartorius 72230/72240
Proline single channel pipettes Sartorius 728230
RNAse free water Thermo Fisher Scientific 10-977-023
RNAzol BD MRC gene RB192
Rocking Platform Thermo Fisher Scientific 11-676-333
RPMI 1640 Fisher MT10040CV
Saponin MilliporeSigma s7900
spoon/spatula Fine Science Tools 10090-17
straight cutting scissors Fine Science Tools 14060-11
Triton X-100 MilliporeSigma t8787
True Blue Substrate VWR 95059-168
Trypsin MilliporeSigma T3924-100ML

References

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Brien, J. D., Hassert, M., Stone, E. T., Geerling, E., Cruz-Orengo, L., Pinto, A. K. Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse. J. Vis. Exp. (150), e59632, doi:10.3791/59632 (2019).

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