Dieses Protokoll beschreibt einen hochempfindliche und hohen Durchsatz Neutrophilenzahl extrazelluläre Falle (NET) Assay für die halbautomatische Quantifizierung von ex-Vivo NET Bildung durch Immunfluoreszenz dreidimensionale konfokalen Mikroskopie. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um NET Bildung und Abbau nach verschiedenen Reize zu bewerten und kann verwendet werden, um mögliche NET gezielte Therapien zu studieren.
Neutrophilenzahl extrazelluläre Traps (NETs) sind immunogen extrazelluläre DNA-Strukturen, die von Neutrophilen auf eine Vielzahl von Triggern ausgelöst werden können. Netze haben als ein wichtiger Wirt Abwehrmechanismus dienen, fallen und tötet Mikroorganismen, nachgewiesen. Auf der anderen Seite haben sie in vielfältigen systemischen Autoimmunerkrankungen verwickelt. Netze sind immunogen und toxischen Strukturen, die einen Pool von entsprechenden Autoantigene, einschließlich Anti-Neutrophilen-cytoplasmatische Antikörper (ANCA) enthalten-assoziierten Vaskulitis (AAV) und systemischer Lupus erythematodes (SLE). Verschiedene Formen der Netze können je nach den Reiz ausgelöst werden. Die Höhe der Netze kann quantifiziert werden, mit verschiedenen Techniken, einschließlich DNA-Release im Überstände, DNA-komplexiert mit NET-Moleküle wie Myeloperoxidase (MPO) oder Neutrophilen Elastase (NE), das Vorhandensein von citrullinierte Messung Messung Messung Histone durch Fluoreszenzmikroskopie oder Fluss durchflusszytometrischen Erfassung von NET-Komponenten, die alle unterschiedliche Eigenschaften in Bezug auf ihre Spezifität, Sensitivität, Objektivität und Menge. Hier ist ein Protokoll, ex Vivo NET Bildung in einer hochsensiblen, Hochdurchsatz-Weise mithilfe von dreidimensionalen Immunfluoreszenz konfokalen Mikroskopie zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um verschiedene Forschungsfragen über NET Bildung und Abbau in Gesundheit und Krankheit zu beheben.
Die Bildung von Neutrophilen extrazelluläre Traps (NETs) ist der Prozess in der Neutrophilen ihre DNA in eine extrazelluläre dreidimensionale (3D) Web wie komplexiert mit einer breiten Palette von antimikrobiell und gefährliche Moleküle, körnige Struktur veröffentlichen und zytoplasmatischen Enzyme, Peptide und Proteine. Diese immunogen und toxischen Strukturen haben eine wichtige physiologische Rolle in der angeborenen Immunabwehr von gesunden Personen durch fangen und töten infektiösen Erreger1. Sie haben jedoch auch gezeigt worden, Thrombose2 und verschiedenen systemischen Autoimmunerkrankungen, einschließlich Anti-Neutrophilen-cytoplasmatische Antikörper (ANCA) beteiligt sein-Vaskulitis (AAV)3, systemischer Lupus erythematodes (SLE verbunden ),4,5, antiphospholipid-Syndrom (APS)2,6, rheumatoide Arthritis (RA), Psoriasis und Gicht7,8,9.
In-vitro-NET Bildung wurde weithin mit chemische Verbindung Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA), untersucht die massive NET Bildung induziert. Die meisten physiologischen Reize induzieren jedoch viel niedrigeres Niveau NET Bildung10. Studie NET-Trigger in, z. B. einer Autoimmun-Krankheit ist ein standardisierte, sensibel, Hochdurchsatz-quantitative Assay zu erkennen und zu quantifizieren, NET Bildung erforderlich. Quantifizierung der Netze erweist sich als problematisch und wird derzeit durch verschiedene Methoden, jeweils mit ihren eigenen Vorzüge und Grenzen11durchgeführt. Eine häufig verwendete Methode ist der Nachweis von DNA in die Überstände12, das Ziel aber unterscheidet nicht zwischen dem Ursprung der DNA (Apoptose, nekrotische, Netze), und ist daher nicht sehr spezifisch für Netze. Zweitens, Enzym-linked Immunosorbentprobe Assays (Elisa) der DNA komplexiert mit NET-spezifische Proteine, beispielsweise Myeloperoxidase (MPO) oder Neutrophilen Elastase (NE), einen konkreteren Ansatz, Netze zu erkennen und wurden demonstriert korrelieren gut mit Citrullinierte Histon-3 (CitH3) positive Netze13. Allerdings ist es nicht bekannt, ob diese Methode empfindlich genug ist, um alle Netze (z. B. MPO, NE, und negative NETs CitH3) abholen. Ein dritter Ansatz ist Immunfluoreszenz-Mikroskopie, die verwendet wird, um Co Lokalisierung von NET-assoziierter Moleküle (NE, MPO, CitH3) mit extrazellulärer DNA, Netze zu quantifizieren zu erkennen. Diese Methode ist in der Regel spezifisch für Netze, aber es kann nicht als Hochdurchsatz-Verfahren angewendet werden und ist nicht Ziel wegen Befangenheit Beobachter. Darüber hinaus berücksichtigt diese Methode nicht MPO-, NE-, CitH3-Negative Netze, die häufig abhängig von der verwendeten NET-Trigger14,15vorhanden sind. Flow Cytometry Ansätze erkennen Netze durch eine geänderte vorwärts/seitwärts Streuung (FSC/SSC) Schwellung des Kerns in NET-Ting Neutrophilen16angibt. Diese Methode nimmt berücksichtigt die verschiedenen Formen der NET Formation, die identifiziert wurden, nicht die Schwellung des Kernes, wie vital NET Bildung17nicht einbeziehen könnte. Zu guter Letzt wurde Immunfluoreszenz konfokalen Mikroskopie zu visualisieren und zu quantifizieren NET Bildung durch direkt beflecken extrazelluläre DNA mit einer Zelle-undurchlässig Färbung, die extrazelluläre DNA12,18Flecken angewendet. In der Regel 5 bis 10 Hochleistungs-Felder sind manuell abgeholt und bewertet, die deckt 1-5 % von jedem Bohrloch einer 96-Well-Platte11,17. Manuelle Auswahl der Bilder ist nicht immer Objektiv, anfällig für Verzerrungen und nicht attraktiv für Hochdurchsatz-Analyse. Ein automatisierte, Hochdurchsatz-NET Quantifizierung-Assay wurde vor kurzem entwickelt die abgebildet 11 % des Brunnens in einer 3D Weise über 13 µm durch Z-stacked Immunfluoreszenz konfokalen Mikroskopie, was wiederum zu einer hochsensiblen Technik Netze zu beurteilen, im Vergleich zu den herkömmlichen Methoden10. Der vorliegende Bericht beschreibt das letzte Protokoll um netto Formation durch eine automatisierte, hochsensiblen Assay mit 3D konfokalen Mikroskopie, die abgebildete Gesamtfläche von 45 % von jedem Bohrloch erreicht und umfasst 27 µm durch Z-Stapel zu quantifizieren. Dieses Protokoll eignet sich für niedrige Konzentrationen von Netto Bildung in eine objektive und unvoreingenommene Weise mit einer hohen Empfindlichkeit zu quantifizieren.
Der wichtigste Teil des Assays muss frisch isolierte Neutrophile für jedes Experiment zu verwenden, da Neutrophile kurzlebig sind und sterben, wenn gefroren. Dies erfordert einen gesunden Spenders jedes Mal, die einige Variationen durch Spender Merkmale implizieren könnte. Eine dieser Variationen ist den Aktivierungsstatus der Neutrophilen. Neutrophile konnte bereits in-vivo vor Isolation aktiviert werden. Darüber hinaus Neutrophilen in der Isolierung Schritte aktiviert werden können, insbesondere während der Lyse der Erythrozyten, daher ein erfahrene Handler der Neutrophilen ist erforderlich, um die Aktivierung von Neutrophilen zu minimieren. Im allgemeinen Isolierung der Neutrophilen durchgeführt werden sollte, so bald wie möglich nach Blut zeichnen und das Experiment sollte nicht angehalten werden, um übermäßige spontane Aktivierung zu vermeiden. Zweitens sollte die grobe Behandlung der Neutrophilen vermieden werden. Als solche ist der bemerkenswerten Vorteil des beschriebenen Protokolls die minimale Pipettieren Eingriffe, sobald Neutrophilen in eine 96-Well-Platte ausgesät werden. Wichtig ist, ist der Aktivierungsstatus der Neutrophilen im unstimulierte Zustand am besten beurteilen, dieser Assay empfindlich niedrige Konzentrationen von Netto Bildung erkennen kann. Ein weiterer Faktor, der den Test beeinflussen könnten ist die Verwendung des FCS im Medium. Der Anteil der FCS wurde von 10 % auf 2 % zu vermeiden, die mögliche Unterdrückung der NET Bildung durch antioxidative Aktivität19,20 oder die mögliche Aktivierung von Neutrophilen trotz Hitzeinaktivierung verringert. Kultur ohne FCS oder mit der Nutzung verschiedener Medien ist nicht versucht worden. Eine unstimulierte oder mittlere Kontrolle ist immer mitgenommen bei der Durchführung des Tests müssen einen Hinweis auf das Hintergrundsignal (z. B., Aktivierungsstatus der Neutrophilen). Fachen Anstieg für jede Anregung im Vergleich zu den unstimulierte Probe wird angezeigt, um konsistente Ergebnisse über verschiedene Experimente mit den gleichen Reiz zu erreichen.
Ein wichtiger Faktor für einen möglichen hohen Hintergrund ist der extrazelluläre DNA Färbung, die den Prozess der NET Bildung zusammenhängt. Der vorliegende Test versucht, dies durch Entfernen der extrazellulären DNA Färbung sofort nach der kurzen Inkubationszeit von 15 min und durch die Analyse der Plattenrandes direkt nach der Fixierung zu reduzieren. Daher ist es unerlässlich, eine erweiterte confocal Mikroskop zu verwenden, die genügend Geschwindigkeit und analytische Kraft, die 96-Well-Platte zu erfassen hat innerhalb 1 bis 2 h. automatische Einstellung der Belichtungszeit und konzentrieren wird empfohlen. Als solche kann die Mikroskop-Einstellung variieren zwischen jeder Probe und Experimentieren in Bezug auf die Farbe Intensität Schwelle, die für insgesamt optimale Bildqualität erforderlich ist. Die letztere Einflüsse, die die eventuelle Möglichkeit, Neutrophilen und Netze und die optimale Einstellung korrekt zu quantifizieren sollte daher mithilfe mehrerer Kontrollproben (z. B. Serum von gesunden Kontrollpersonen) bestätigt werden. Bei der Analyse der aufgenommenen Bilder ermöglicht die Verwendung von einem Pixel Schwelle und Größe Schwelle in das Auswertungsprogramm für eine bessere Auswahl der NET Bildung.
Extrazelluläre DNA abgeleitet aus NET-Formation kann unterschiedliche Tod Wege, einschließlich NETosis, Necroptosis, Pyroptosis, Ferroptosis oder sogar nicht-lytische Prozess der lebenswichtigen NET Bildung1zurückzuführen. Als solche ist eine Einschränkung des vorliegenden Tests durch Färbung nur für extrazelluläre DNA gibt es keine Differenzierung zwischen NET Bildung und andere entsprechende Zelle Tod Wege möglich. Es ist möglich, dies zu erreichen, indem entweder selektive Inhibitoren der unterschiedlichen Tod Wege zu unterscheiden zwischen den verschiedenen zugrunde liegenden NET Bildung oder durch separate Immunostainings bestätigen das Vorhandensein spezifischer NET Marker wie citH3 und NE, zusammen lokalisiert mit der DNA. Die Co Lokalisierung von extrazellulärer DNA mit citH3 und NE wurde vor kurzem für diese Probe10bestätigt. Der Vorteil, dass NET spezifische Marker in diesem Test erlaubt es, um alle Formen von Netto Bildung führt zu die Extrusion von DNA von Neutrophilen so vollständig und so objektiv wie möglich mit dem Potenzial von Hochdurchsatz-Screening zu beurteilen. Die Anwendbarkeit dieses Protokolls nachweislich an einem Studium von niedrigen Niveau NET Induktion vermittelt durch Immunkomplexe in Autoimmun-Krankheit, in dem die Fähigkeit, qualitative und quantitative Unterschiede erkennen möglicherweise wichtiger als die Art des Verfahrens mit10,21,22. Zur Veranschaulichung, dass dieser neuartige NET Quantifizierung Assay Mehrwert für verschiedene Forscher untersuchen verschiedene Aspekte des NET Bildung sein kann. Kleine Korrekturen an der Assay lassen sich einfach umsetzen: Anpassung der Stimulationsdauer, die Verwendung eines Lieblings NET Marker auf einen bestimmten Tod Weg NET Bildung konzentrieren, die Verwendung von verschiedenen Vergrößerung oder die Verwendung von verschiedenen NET Kriterien in die Quantifizierung und Analyse.
Zusammenfassend ist das Protokoll zur Verfügung gestellt einen hochsensiblen breit anwendbar-Assay für die halbautomatische Quantifizierung von Netto Bildung für die Bewertung von ex-Vivo Induktion der Netze auf verschiedene Reize.
The authors have nothing to disclose.
Die Arbeit der Eline J. Arends und Y.K Onno Teng wird von der niederländischen Kidney Foundation (17OKG04), Clinical Fellowship von der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (90713460) unterstützt. Laura S. van Dam Arbeit wird von der Foundation for Research in Rheumatologie (FOREUM) unterstützt.
Aqua Sterile H2O | B. Braun, Melsungen, Germany | 12604052 | |
Fetal bovine serum (FCS) | Bodinco, Alkmaar, The Netherlands | Used in high concentrations it could influcence NET formation | |
Ficoll 5,7% – amidotrizoaat 9% density 1,077 g / mL | LUMC, Leiden, The Netherlands | 97902861 | |
Immunofluorescence confocal microscope | Image Xpress Micro Confocal (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) | ||
Neutralization PBS (10x) | Gibco, Paisley, UK | 70011-036 | |
Penicillin / streptomycin (p/s) | Gibco, Paisley, UK | 15070063 | |
Phenol red free RPMI 1640 (1x) | Gibco, Paisley, UK | 11835-063 | Phenol red can interfere with the immunofluorescence signal |
Phosphate-buffered saline (PBS) | B. Braun, Melsungen, Germany | 174628062 | |
PKH26 2 uM Red fluorescent cell linker | Sigma Aldrich Saint-Louis, MO, USA | PKH26GL-1KT | PKH are patented fluorescent dyes and a cell labeling technology named after their discoverer Paul Karl Horan |
Program for scientific multidimensional images analysis | ImageJ, Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA | ||
RPMI medium 1640 (1x) | Gibco, Paisley, UK | 52400-025 | |
Sytox green 5 mM Impermeable DNA dye | Gibco, Paisley, UK | 57020 | |
Trypan blue stain 0,4% | Sigma Aldrich, Germany | 17942E | |
96 well, black, flat bottom, tissue culture treated plate | Falcon, NY, USA | 353219 |