İn vitro ve hücre içi şeklinde küçük molekül araştırmak için kullanarak Pre-mRNA yapısal değişiklikler indüklenen

Seçmeli 2′-hidroksil asilasyonu astar uzantısı (SHAPE) tarafından analiz her nükleotit bir RNA dizisinin ilgi içinde kinetik ölçme ve tek nükleotid çözünürlük¹ikincil yapı elucidating bir yöntemdir. Şekil metodolojileri, tüp bebek koşulları^2,3,4 (arıtılmış RNA içinde tanımlanmış arabellek sistem) her ikisi de ve içinde yaşayan memeli hücreleri^5,6, ikincil araştırmak için geliştirilmiştir Orta uzunlukta RNA dizilerinin yapısı (genellikle < hücre içi şekil için 1.000 nukleotid ve < tüp bebek şekil için 200 nukleotid). Bağlama küçük molekül metabolitleri^2,4,7,8 RNA etkileşim üzerine reseptör RNA yapısal değişiklikler değerlendirmek ve mekanik eylemler Çalışmaya özellikle yararlıdır hedefleme-RNA molekülleri sırasında ilaç geliştirme^9,10.

İlaç keşif RNA hedefleme son zamanlarda ilgi gibi akademik laboratuvarları ve ilaç endüstrisi^11,12 farklı yaklaşımlar ve stratejileri^{13,14,15 çekti ,16}. Son RNA hedefleme küçük moleküller klinik kullanım için iki yapısal olarak farklı deneysel ilaç, LMI-070¹⁷ ve RG-7916^18,19, umut verici gösterdi kas spinal atrofisi (SMA), için örnekler Aşama II klinik çalışmalar²⁰sonuçlarında. Her iki moleküller vardı motor nöron (SMN) hedef yaşama 2 pre-mRNA gösterdi ve Tutkallama işleminin SMN2 gen^6,17,21düzenler. Biz daha önce vitro ve hedef RNA yapısal değişiklikler RG-7916 SMN-C2⁶bilinen bir analog huzurunda incelenmesi şeklinde hücre içi uygulama gösterdi.

Prensip olarak, şekil tarafsız bir şekilde her nükleotit bir kendi kendine su verme asilasyonu reaktif aşırı miktarda huzurunda bir RNA dizisinin 2′-OH asilasyonu oranını ölçer. Asilasyonu reaktif su kısa bir yarı ömrü ile kararlı değil (örneğin, T_1/2 = 17 s 1-metil-7-nitroisatoic anhidrit; veya 1 M 7, 2-methylnicotinic asit imidazolide ~ 20 dakika veya NAI)²² ve duyarsızlık kimliğine üsleri²³. Her nükleotit dinamiklerini doğru bir değerlendirme dönüştürülebilir esnek bazlar 2′-OH grupları daha uygun bir asilasyonu sonuçlanır. Özellikle, bir nükleotid baz çifti içinde genellikle daha az reaktif NAI ve 1 M 7 gibi bir 2′-OH değiştirme reaktif için unpaired bir tane daha.

RNA şablonu ve nereye 2′-OH asilasyonu gerçekleşir kaynak bakarak, şekil genellikle tüp bebek ve hücre içi şekle kategorilere ayrılabilir. Vitro şekli kullanır saf T7 RNA transkripsiyonu ve Deneysel tasarımlar hücresel bir bağlamda yoksun. Hücre içi şeklinde RNA şablon transkripsiyon ve 2′-OH asilasyonu canlı hücreler içinde oluşur; Bu nedenle, sonuçlar RNA yapısal modeli hücresel bir bağlamda özetlemek. Hücre içi şekil için şekil vivo olduğu gibi edebiyat²⁴canlı hücrelerde taşınan şekil için anılır olmuştur. Beri bu deney bir hayvan gerçekleştirilmez, doğruluk için hücre içi şekil olarak bu deneme olarak.

Tüp bebek ve hücre içi şekli astar uzantısı aşaması için stratejiler de farklıdır. Tüp bebek şeklinde Ters transkripsiyon huzurunda Mg^{2 +}2′-OH asilasyonu konumunda durur. ³²P-etiketli astar uzantısı bu nedenle bir grupta polyacrylamide jel elektroforez (sayfa) olarak görünür ve grup yoğunluğunu asilasyonu oranı¹‘ e orantılıdır. Hücre içi şeklinde Ters transkripsiyon 2’-OH, rastgele mutasyonlar oluşturur pozisyon huzurunda Mn^{2 +}sigara. Her nükleotit mutational oranı tarafından derinlik yeni nesil sıralama içinde yakalanabilir ve şekil reaktivite tek nükleotid çözünürlükte sonra hesaplanabilir.

Düşük sinyal-gürültü oranı hücre içi şekil için potansiyel sorun (değiştirilmemiş dizileri yeni nesil sıralama okuma çoğunu işgal yani, 2′-OH grupları çoğunluğu değiştirilmemiş, ise). Son zamanlarda, bir yöntem 2′-OH zenginleştirmek için RNA değiştiren, vivo olduğu gibi şekli (icSHAPE)’yi anılacaktır, Chang laboratuvar²⁵tarafından geliştirilmiştir. Bu zenginleştirme yöntemi RNA etkileşimleri, özellikle transcriptome çapında sorgulama gibi zayıf küçük moleküller okumak avantajlı olabilir.