利用体外和细胞内形状研究小分子诱导的预 mrna 结构变化

选择性 2 ‘-羟基酰化分析引物延伸 (shape) 是一种测量每个核苷酸在感兴趣的 rna 序列中的动力学的方法, 并阐明单核苷酸^{分辨率 1}下的二级结构。在体外条件 2^,3,4 (纯化 rna 在一个定义的缓冲系统) 和在活哺乳动物细胞^{5, 6,已经}开发了 shape 方法来研究继发中长 rna 序列的结构 (通常和 lt;1,000 核苷酸用于细胞内形状和 lt;200 核苷酸体外形状)。它是特别有用的评估的结构变化后, 结合 rna 相互作用的小分子代谢物^{2,4,7,8 和研究}机械作用在药物开发过程中的 rna 靶向分子 9^,10。

rna 靶向药物发现最近通过不同的方法和策略引起了学术实验室和制药业的关注 11^、 12,^{分别为 13、14、15 ,16}。最近针对临床使用的小分子的例子包括两种结构不同的实验药物, lmi-070 17 和 rg-7916 ^{18,19, 用于}脊髓肌肉萎缩 (sma), 这表明很有希望在第二阶段临床试验²⁰。这两种分子都被证明是针对运动神经元 (smn) 2 的存活, 并调节 smn2 基因 6^{、17、21 的}剪接过程.我们之前展示了体外和细胞内形状在检测目标 rna 结构变化的应用, 在存在的类似的 rg-7916 被称为 smn-c2^6.

原则上, shape 以无偏见的方式测量 rna 序列的每个核苷酸在存在过量的自淬火酰化试剂的情况下的 2 ‘-oh 酰化速率。酰化试剂在水中不稳定, 对 1-甲基-7-亚硝基二酸酐的半衰期较短 (例如, 1 -甲基-7-亚硝基二氢化物的半衰期为 17; 1 m7, 2-甲基烟酸咪唑 (nai) 22 的半衰期较短^,对其同一性不敏感, 对其同一性不敏感。基地²³。这将导致更有利的酰化 2 ‘-oh 组的柔性碱基, 这可以转化为一个准确的评估动态的每个核苷酸。具体而言, 基对中的核苷酸通常比未配对的核苷酸对 2 ‘-oh 改性试剂 (如 nai 和 1m7) 的反应性较低。

查看 rna 模板的来源和 2 ‘-oh 酰化发生的位置, shape 通常可分为体外和细胞内形状。体外 shape 使用纯化的 t7 转录 rna, 在实验设计中缺乏细胞环境。在细胞内形态中, rna 模板转录和 2 ‘-oh 酰化都发生在活细胞内;因此, 研究结果可以在细胞环境中重述 rna 结构模型。在文献²⁴中, 细胞内形状被称为活体形状, 用于活细胞中携带的形状。由于这个实验不是在动物身上进行的, 我们把这个实验称为细胞内形状的准确性。

体外引物延伸期和细胞内形状的策略也不同。在体外形态中, 逆转录酶在 mg2⁺存在的情况下停止在 2 ‘-oh 酰化位置。因此, 在聚丙烯酰胺凝胶电泳 (page) 中, 一个³²p-ld 引物延伸率显示为一个带, 该带的强度与酰化速率¹成正比。在细胞内形态中, 逆转录酶在 mn^{2 +}存在的情况下, 在 2 ‘-oh 加合物位置产生随机突变。通过深度下一次测序可以捕获每个核苷酸的突变速率, 然后可以计算单核苷酸分辨率下的 shape 反应性。

细胞内 shape 的一个潜在问题是低信噪比 (即, 大多数 2 ‘-oh 组未被修改, 而未修改的序列占据了下一代测序中的大部分读数)。最近, 由 chang 实验室²⁵开发了一种浓缩2-oh 改性 rna 的方法, 该方法被称为体内点击 shape (icshape)。这种浓缩方法可能有利于研究弱小分子, 如 rna 相互作用, 特别是在转录全范围的审讯中。