تستخدم في المختبر وفي خلايا الشكل للتحقيق في جزيء الصغيرة التي يسببها مرناً قبل إجراء تغييرات هيكلية
Summary
بروتوكولات مفصلة لكلا أسيليشن في المختبر وفي خلايا انتقائية 2-هيدروكسيل تحليلها بواسطة التمهيدي ملحق (الشكل) تجارب لتحديد هيكل تسلسل قبل مرناً لمصلحة حضور جزيء صغير استهداف الجيش الملكي النيبالي الثانوية المعروضة في هذه المقالة.
Abstract
عملية تطوير العقاقير للجزيئات الصغيرة التي تستهدف الجيش الملكي النيبالي، توضيح التغييرات الهيكلية على تفاعلها مع تسلسل الحمض النووي الريبي الهدف هو المطلوب. نحن نقدم هذه الوثيقة التفصيل في المختبر وانتقائية في الخلية 2-هيدروكسيل أسيلاتيون تحليلها من قبل تمديد التمهيدي البروتوكول (الشكل) لدراسة التغير الهيكلي حضور دواء تجريبي لضمور العضلات الشوكي (SMA)، البقاء على قيد الحياة من الجيش الملكي النيبالي الخلايا العصبية الحركية (العليا)-C2, وفي إكسون 7 من قبل-مرناً الجينات SMN2. في الشكل في المختبر، وهو تسلسل الحمض النووي الريبي من 140 النيوكليوتيدات التي تحتوي على SMN2 إكسون 7 نسخها من قبل بوليميريز الحمض النووي الريبي T7 ومطوية بحضور الجالي-C2 وتعديله فيما بعد بكاشف أسيليشن خفيف 2 ‘–أوه، إيميدازوليدي حمض 2-ميثيلنيكوتينيك (ناي). هذا adduct 2 ‘–يا ناي هو كذلك سبر طريق 32تمديد التمهيدي المسمى ف وحلها بالتفريد جل polyacrylamide (صفحة). على العكس من ذلك، أسيليشن 2 ‘-OH في الشكل في الخلية يأخذ مكان في الموقع مع الجالي-C2 ملزمة الخلوية الحمض النووي الريبي في الخلايا الحية. ثم اتسع نطاق تسلسل مرناً قبل إكسون 7 في الجينات SMN2، جنبا إلى جنب مع الطفرات المستحثة بالشكل في تمديد التمهيدي، بكر ويخضع لتسلسل الجيل القادم. المقارنة بين المنهجيتين، الشكل في المختبر هو وسيلة أكثر فعالية من حيث تكلفة ولا تتطلب الطاقة الحسابية لتصور النتائج. ومع ذلك، الطراز المستمدة من شكل الجيش الملكي النيبالي في المختبر أحياناً ينحرف عن هيكل الثانوي في سياق خلوية، يرجح أن سبب فقدان جميع التفاعلات مع الحمض النووي الريبي ملزم البروتينات. الشكل في الخلية لا تحتاج إلى مكان مواد مشعة وغلة بنية الحمض النووي الريبي ثانوي أكثر دقة في سياق الخلوية. وعلاوة على ذلك، الشكل في الخلية المطبقة عادة لتسلسل مجموعة من الجيش الملكي النيبالي أكبر (~ 1,000 النيوكليوتيدات) باستخدام تسلسل الجيل القادم، مقارنة في المختبر الشكل (~ 200 النيوكليوتيدات) التي عادة ما تعتمد على تحليل صفحة. في حالة المستمدة من إكسون 7 في SMN2 قبل-مرناً، الشكل في المختبر وفي خلايا الحمض النووي الريبي النماذج مشابهة لبعضها البعض.
Introduction
أسيليشن انتقائية 2-هيدروكسيل تحليلها بواسطة الملحق التمهيدي (الشكل) أسلوب لقياس الحركية من كل النوكليوتيدات في تسلسل الحمض النووي الريبي للفائدة وتوضيح هيكل الثانوية في قرار واحد-النوكليوتيدات1. المنهجيات الشكل، سواء في الظروف المختبرية2،3،4 (تنقية الحمض النووي الريبي في نظام المخزن مؤقت معرفة) وفي خلايا الثدييات الحية5،6، وقد وضعت للتحقيق الثانوي هيكل تسلسل متوسط طول الحمض النووي الريبي (عادة < النيوكليوتيدات 1,000 للشكل في الخلية و < النيوكليوتيدات 200 للشكل الأنبوبي). أنها مفيدة بشكل خاص لتقييم التغيرات الهيكلية في مستقبلات الحمض النووي الريبي عليها ملزمة للتفاعل الحمض النووي الريبي جزيء صغير والايضات2،4،،من78 ودراسة الإجراءات آليا من جزيئات الحمض النووي الريبي استهداف خلال المخدرات التنمية9،10.
اكتشاف المخدرات تستهدف الجيش الملكي النيبالي مؤخرا لفت الانتباه في المختبرات الأكاديمية و الصناعة الصيدلانية11،12 عبر مختلف النهج والاستراتيجيات13،،من1415 ،16. وتشمل الأمثلة الأخيرة الجزيئات الصغيرة التي تستهدف الجيش الملكي النيبالي للاستخدام السريري العقاقير التجريبية هيكلياً متميزة LMI-07017 و RG-791618،19، لضمور العضلات الشوكي (SMA)، الذي أظهر واعدة النتائج في مرحلة التجارب السريرية الثاني20. كل الجزيئات وقد أثبت لبقاء الهدف من الخلايا العصبية الحركية (الجالي) قبل 2-مرناً وتنظيم عملية الربط SMN2 الجينات6،،من1721. أظهرنا سابقا التطبيق في المختبر والشكل في الخلية في دراسة التغيرات الهيكلية المستهدفة الحمض النووي الريبي حضور تمثيلي للنمو الحقيقي-7916 المعروفة باسم C2 الجالي6.
من حيث المبدأ، التدابير شكل معدل أسيليشن 2 ‘–يا كل نوكليوتيد تسلسل الحمض النووي الريبي حضور المبالغ الزائدة من كاشف أسيليشن التبريد الذاتي بطريقة غير متحيزة. الكاشف أسيلاتيون ليست مستقرة في الماء، وله فترة قصيرة (مثل، T1/2 = 17 s 1-الميثيل-7-نيترويساتويك الخل؛ أو 1 م 7، ~ 20 دقيقة إيميدازوليدي حمض 2-ميثيلنيكوتينيك، أو ناي)22 وعدم الاكتراث بالهوية قواعد23. هذه النتائج في أسيليشن مواتية أكثر المجموعات 2 ‘–أوه القواعد المرنة، التي يمكن أن تتحول إلى تقييم دقيق لديناميات كل النوكليوتيدات. على وجه التحديد، النوكليوتيدات في قاعدة زوج عادة أقل رد الفعل من أحد مزاوج إلى كاشف تعديل 2 ‘–أوه، مثل ناي و 1 م 7.
النظر في مصدر القالب الجيش الملكي النيبالي، والتي يجري فيها أسيليشن 2 ‘–يا، ويمكن عموما تصنيف الشكل في الشكل في المختبر وفي الخلية. في استخدامات الأنابيب الشكل T7 المنقي نسخها الجيش الملكي النيبالي ويفتقر إلى سياق خلوية في تصاميم تجريبية. في الشكل في الخلية، وتحدث كل من الجيش الملكي النيبالي قالب النسخ وأسيليشن 2 ‘–يا داخل الخلايا الحية؛ ولذلك، يمكن أن الخص النتائج النموذج الهيكلي الجيش الملكي النيبالي في سياق خلوية. قد أحيلت إلى الشكل في الخلية كما هو الحال في فيفو الشكل للشكل في الخلايا الحية في الأدب24. حيث لم يتم تنفيذ هذه التجربة في حيوان، نحن وصف هذه التجربة على الشكل في الخلية للتأكد من دقتها.
كما تختلف أيضا استراتيجيات لمرحلة التمديد التمهيدي للشكل في المختبر وفي الخلية. في الشكل في المختبر، وتوقف النسخ العكسي في موقف أسيليشن 2 ‘–يا حضور Mg2 +. ولذلك يظهر ملحق التمهيدي 32فالمسمي كعصابة في جل polyacrylamide التفريد (صفحة) وكثافة الفرقة يكون متناسباً مع معدل أسيليشن1. في الشكل في الخلية، وينشئ النسخ العكسي الطفرات العشوائية في 2 ‘–أوه adduct موقف حضور Mn2 +. معدل كل النوكليوتيدات حيث يمكن التقاطها بواسطة في عمق الجيل التالي التسلسل، ويمكن ثم حساب مفاعليه الشكل في قرار واحد-النوكليوتيدات.
مشكلة محتملة للشكل في الخلية هو نسبة الإشارة إلى الضوضاء منخفضة (أي أغلبية المجموعات 2 ‘–يا معدلة، بينما تسلسل غير معدلة تحتل أكثر من القراءة في تسلسل الجيل القادم). في الآونة الأخيرة، طريقة لإثراء 2 ‘–أوه تعديل الحمض النووي الريبي، المشار إليها كما هو الحال في فيفو انقر فوق الشكل (إيكشابي)، وضعه مختبر تشانغ25. قد يكون هذا الأسلوب الإثراء مفيدة في دراسة الجزيئات الصغيرة ضعيفة مثل التفاعلات الحمض النووي الريبي، خاصة في استجواب على نطاق الترنسكربيتوم.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الشكل في المختبر، من الضروري استخدام قالب الحمض النووي الريبي متجانسة ذات جودة عالية. ومع ذلك، غلة T7 النسخ، غالباً ما تسلسل غير متجانسة36. وبخاصة، تسلسل مع النوكليوتيدات ± 1 في 3 ‘-المحطة مع عائدات لا يستهان بها36 عادة من الصعب إزالتها بتنقية جل polyacrylamide. قالب الحمض…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تسنى هذا العمل بالمنحة R01 المعاهد الوطنية للصحة (NS094721، K.A.J.).
Materials
| DNA oligonucleotide | IDT | gBlock for > 200 bp DNA synthesis | |
| Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix | Thermo Fisher | F566S | |
| NucleoSpin gel and PCR clean-up kit | Takara | 740609.50 | |
| MegaScript T7 transcription kit | Thermo Fisher | AM1333 | Contains 10X reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase |
| DEPC-treated water | Thermo Fisher | 750023 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Thermo Fisher | LC6876 | |
| 40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1) | Bio-Rad | 1610146 | |
| 10X TBE buffer | Thermo Fisher | 15581044 | |
| Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34133 | |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
| SYBR-Safe dye | Thermo Fisher | S33102 | |
| 6 % TBE-urea mini-gel | Thermo Fisher | EC6865BOX | |
| ChemiDoc | Bio-Rad | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| γ-32P-ATP | Perkin Elmer | NEG035C005MC | |
| Hyperscreen™ Intensifying Screen | GE Healthcare | RPN1669 | calcium tungstate phosphor screen |
| phosphor storage screen | Molecular Dynamics | BAS-IP MS 3543 E | |
| Amersham Typhoon | GE Healthcare | ||
| NAI (2M) | EMD Millipore | 03-310 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | AM9515 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18090010 | Contains 5X RT buffer, SuperScript IV |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | |
| ddNTP set (5mM) | Sigma | GE27-2045-01 | |
| large filter paper | Whatman | 1001-917 | |
| Gel dryer | Hoefer | GD 2000 | |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Also contains RNase A and protease K |
| SMN2 minigene34 | Addgene | 72287 | |
| Heat inactivated FBS | Thermo Fisher | 10438026 | |
| Pen-Strep | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher | 31985062 | |
| FuGene HD | Promega | E2311 | |
| TrpLE | Thermo Fisher | 12605010 | |
| DPBS without Ca/ Mg | Thermo Fisher | 14190250 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596018 | |
| RNeasy mini column | Qiagen | 74104 | Also contains RW1, RPE buffer |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Contains DNase I and RDD buffer |
| Deionized formamide | Thermo Fisher | AM9342 | |
| MnCl2•4H2O | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| random nonamer | Sigma-Aldrich | R7647 | |
| SuperScript First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 11904-018 | Contains 10X RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase |
| AccuPrime pfx DNA polymerse | Thermo Fisher | 12344024 | |
| NextSeq500 | Illumina | ||
| NucAway column | Thermo Fisher | AM10070 | for desalting purpose |
References
- Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. Selective 2′-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).
- Trausch, J. J., et al. Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).
- Souliere, M. F., et al. Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).
- Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches. Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).
- Spitale, R. C., et al. RNA SHAPE analysis in living cells. Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).
- Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).
- Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches. Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).
- Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch. Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).
- Abulwerdi, F. A., et al. Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).
- Shortridge, M. D., et al. A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing. ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).
- Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. Principles for targeting RNA with drug-like small molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).
- Mullard, A. Small molecules against RNA targets attract big backers. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).
- Shortridge, M. D., Varani, G. Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules. Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).
- Gallego, J., Varani, G. Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges. Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).
- Rizvi, N. F., Smith, G. F. RNA as a small molecule druggable target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).
- Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules. Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).
- Palacino, J., et al. SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice. Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).
- Ratni, H., et al. Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA). Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).
- Naryshkin, N., et al. SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy. Science. 345, (2014).
- Chiriboga, C., et al. Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003). Neurology. 90, (2018).
- Sivaramakrishnan, M., et al. Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers. Nature Communications. 8, (2017).
- Lee, B., et al. Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells. RNA. 23, 169-174 (2017).
- Weeks, K. M., Mauger, D. M. Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry. Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).
- Smola, M. J., et al. SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).
- Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).
- Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Selective 2 ′ -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis. Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).
- Hua, Y., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes & Development. 24, 1634-1644 (2010).
- Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
- Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells. PloS One. 9, e115205 (2014).
- Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures. RNA. 15, 294-307 (2009).
- Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes. Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).
- Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. Accurate SHAPE-directed RNA structure determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).
- Qi, H., et al. . Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).
- Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).
- Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP). Nature Methods. 11, 959 (2014).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
- Nilsen, T. W. RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions. Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).
- Velagapudi, S. P., et al. Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).
- Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small. Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).
- Scott, L. G., Hennig, M. RNA structure determination by NMR. Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).
