Aqui, apresentamos um protocolo para projetar e fabricar filmes de silício poroso (PSi) nanoestruturados como transportadores degradáveis para o fator de crescimento do nervo (NGF). Diferenciação neuronal e consequência de PC12 células e ratos raiz dorsal neurônios do gânglio (DRG) caracterizam-se após tratamento com as transportadoras PSi NGF-carregado.
Apesar do grande potencial de NGF no tratamento de doenças neurodegenerativas, sua administração terapêutica representa um desafio significativo, como a proteína não atravessa a barreira hemato – encefálica, devido a suas propriedades químicas e portanto requer a longo prazo entrega para o cérebro para ter um efeito biológico. Este trabalho descreve a fabricação de filmes de PSi nanoestruturados como degradáveis portadores de NGF para entrega sustentada desta proteína sensível. Os portadores de PSi são adaptados especificamente para obter o carregamento de alta eficácia e liberação contínua de NGF por um período de quatro semanas, preservando sua atividade biológica. O comportamento das transportadoras NGF-PSi como um sistema de entrega de NGF é investigado em vitro examinando sua capacidade de induzir a diferenciação neuronal e consequência de células PC12 e dissociada DRG neurônios. Viabilidade celular na presença de portadores de PSi puro e NGF-carregado é avaliada. A bioatividade de NGF liberado das transportadoras que PSi é comparada com o tratamento convencional das administrações de NGF livre repetitivas. Diferenciação de células PC12 é analisada e caracterizada por medição de três diferentes parâmetros morfológicos das células diferenciadas; (i) o número de neuritos extraindo de soma o comprimento dos (ii) o total neuritos e (iii) o número de pontos de ramificação. PC12 células tratadas com os portadores de NGF-PSi demonstram uma profunda diferenciação durante todo o período de lançamento. Além disso, células neuronais DRG, cultivadas com as transportadoras de NGF-PSi mostram uma iniciação de axônio extensa, semelhantes a neurônios tratadocom com administrações de NGF livre repetitivas. As transportadoras sintonizáveis estudadas demonstram os implantes a longo prazo para a liberação de NGF com um potencial terapêutico para doenças neurodegenerativas.
NGF é essencial para o desenvolvimento e a manutenção dos neurônios no sistema nervoso do periférico (SNP)1 e desempenha um papel crucial na sobrevivência e função dos neurônios colinérgicos do prosencéfalo basal no sistema nervoso central (SNC)2. Seu alto potencial farmacológico para o tratamento de doenças neurodegenerativas central, tais como a doença de Alzheimer e de Parkinson, tem sido amplamente demonstrado, com ensaios clínicos atualmente em progresso3,4,5, 6. O maior desafio na entrega de NGF ao SNC reside na sua incapacidade de atravessar a barreira hemato-encefálica (BBB), quando administrados sistemicamente7. Além disso, a susceptibilidade de NGF a rápida degradação enzimática processa sua meia-vida curta e limita significativamente seu uso terapêutico8,9. Portanto, há um desafio não cumprido para projetar sistemas de entrega que permitem uma liberação prolongada e controlada de NGF de maneira segura. Vários sistemas de entrega de NGF, incluindo sistemas baseados em polímero, foram estudados10,11,12,13,14,15, 16 , 17. os perfis de liberação destes sistemas foram muitas vezes caracterizados por uma explosão inicial distinta, seguida por uma liberação lenta e contínua, onde no último estágio, a taxa de liberação foi significativamente mais baixa em comparação com o surto inicial11 ,18,19. Além disso, observaram-se com estes sistemas20inativação da proteína por produtos de degradação ácida dos polímeros (por exemplo, ácido poly(lactic-co-glycolic)) ou perda de Bioatividade NGF durante o processo de encapsulamento.
Nanoestruturados PSi caracteriza-se por várias propriedades atraentes, inclusive sua elevada área superficial, grande volume poroso, biocompatibilidade e degradabilidade sintonizável em fluidos corporais, predestining-lo para uma promissora droga entrega plataforma21, 22,23,24,25,26,,27,28. Seleção adequada de suas condições de anodização permite ajustar facilmente as propriedades estruturais de PSi (por exemplo, porosidade e poros de tamanho) para costurar o carregamento de drogas e cinética de liberação21,27. Além disso, várias rotas químicas convenientes permitem modificar a superfície da PSi e por isso ainda mais ajustar a taxa de dissolução do cadafalso Si sob condições fisiológicas e as taxas de liberação de drogas22,24, 29,30.
Este trabalho centra-se em projetar um sistema de entrega baseado em PSi para liberação controlada prolongada de NGF. O efeito das transportadoras NGF-PSi na diferenciação neuronal e consequência é examinado usando células PC12 e dissociado neurônios DRG. Demonstramos que o NGF carregado manteve sua Bioatividade induzindo a consequência natural do axônio e profunda diferenciação ao longo de um período de 1 mês de lançamento dentro de uma única administração.
Degradáveis nanoestruturados anos2 filmes são fabricadas e empregadas como transportadores para NGF, permitindo sua liberação contínua e prolongada, mantendo sua atividade biológica. O potencial dos2 anos para servir como um sistema de entrega para o NGF é demonstrada em vitro , demonstrando a sua capacidade de liberar a dosagem de NGF suficiente para induzir a diferenciação neuronal e promover a consequência natural de células PC12 e neurônios DRG. Filmes de engenharia podem ser usados como reservatórios a longo prazo do NGF para tratamento futuro em vivo.
As propriedades estruturais dos filmes fabricados PSi foram adaptadas especificamente para carga de NGF; a densidade de corrente do processo eletroquímico gravura foi ajustada para obter o tamanho dos poros de aproximadamente 40 nm, o que seria facilmente acomodar o NGF, uma proteína com um químico de 26.5 kDa32 e um diâmetro característico de ~ 4 nm33, dentro da matriz porosa. Além disso, oxidação térmica do cadafalso porosa foi realizada para habilitar a adsorção física de NGF por atração eletrostática da proteína carregada positivamente à superfície oxidada negativamente carregada de PSi. A química de superfície de PSi exerce um efeito importante sobre a eficácia de carregamento e pode ser facilmente ajustada a fim de melhor controlar as interações entre a carga e a matriz porosa. Essas interações posteriormente ditam a estrutura das moléculas de proteína adsorvida e sua Bioatividade34,35,36. Em conclusão, o sistema foi ajustado para obter a carga ideal de NGF seleccionando cuidadosamente o tamanho de poro adequado, características de superfície e o ideal de solvente e o efeito resultante da dita parâmetros mencionados carregamento o carregamento de proteína eficácia. Portanto, qualquer alteração nos parâmetros de fabricação (por exemplo, densidade de corrente, tempo de gravura, tipo e concentração do dopant ou eletrólito), química de superfície ou composição da solução de carregamento pode afetar a eficácia de carregamento e Bioatividade do carregado de proteína.
A taxa de liberação de uma carga do host2PSi orPSiO geralmente é ditada por uma combinação de dois mecanismos simultâneos, out-difusão das moléculas de carga e a degradação de Si andaime37. A erosão e a taxa de dissolução subsequentes são afetados pelo local de implante, sua patologia e doença estado28,38,39. Foi estabelecido em trabalhos anteriores que, se uma taxa de liberação de diferentes é necessária para uma certa aplicação terapêutica, o perfil de liberação pode ser modificado e prolongado, alterando a química de superfície do PSi superfície38,40, 41. Várias modificações químicas, tais como oxidação térmica, carbonização térmica e técnicas de hydrosilylation, foram mostradas para estabilizar a superfície PSi e afetar sua degradação e consequente carga lançamento35,42 ,,43,44,45. Além disso, um carregamento de NGF nas transportadoras por ligação covalente das moléculas de proteína para o cadafalso de Si através de várias rotas de química de superfície deve resultar em uma liberação mais prolongada, porque a carga só é liberada quando as ligações covalentes são quebrados ou o apoiando a Si matrix é degradado21.
Além disso, seguindo o seu processo de fabricação, PSi pode ser processado em várias configurações, além de filmes finos, tais como micropartículas46, nanopartículas47 ou autônoma membranas,26, que também pode ser empregada como portadores para NGF e necessidades específicas da aplicação conheça.
A fim de ser clinicamente relevantes, o conteúdo de NGF dentro das transportadoras de2 anos deve chegar o intervalo de doses terapêuticas. No método descrito no protocolo, os portadores de2 anos de NGF-carregado são introduzidos em um consistente volume de 2 mL de mídia do celular ou tampão PBS e, portanto, a concentração de solução de carregamento e a respectiva massa de NGF carregada foram ajustados para produzir um lançado o concentração de NGF que é relevante para o sistema testado em vitro . Ao utilizar este método para diferentes sistemas, tais como ambientes ex vivo ou na vivo , a concentração da solução de carregamento o NGF deve ser aumentada e ajustada de acordo com a dose necessária. Alternativamente, maior teor de NGF pode ser obtido através da introdução de várias transportadoras por área testada ou usando áreas maiores de amostras de2 anos.
Além disso, deve notar-se que, nos pontos de tempo posteriores ao longo do período de lançamento, as concentrações de NGF lançadas são muito menores que em pontos de tempo anteriores. O fato de que o fluxo de NGF não é constante ao longo do tempo deve ser considerado ao projetar o sistema de acordo com as necessidades da aplicação.
Entrega de NGF inúmeros sistemas foram desenvolvidos e relatados na literatura, a maioria deles são sistemas baseados em polímero, composto de polímero sintético ou natural conjuga10,11,12,15 , 16 , 17. estes sistemas têm mostrado eficazes liberação sustentada de perfis, no entanto, o período de lançamento, espalhou-se por um período de vários dias com um efeito de explosão significativa. Algumas destas plataformas de entrega sofrem limitações críticas tais como perda de Bioatividade sobre o processo de encapsulamento, que exigem o uso de diferentes estabilizador agentes18,48, bem como sofisticados e complexos técnicas de fabricação16. Um dos maiores desafios na concepção de sistemas de entrega para proteínas é a capacidade de preservar a bioatividade das moléculas em cima de uma armadilha dentro do sistema da transportadora. Proteínas ou peptídeos podem ser carregados em PSi/anos2 no RT ou mesmo a baixas temperaturas sem o uso de solventes orgânicos fortes, que são os dois fatores importantes ao carregar estas biomoléculas sensíveis. Estudos anteriores demonstraram que a química de superfície2 PSi/anos desempenha um papel crucial em minimizar possível desnaturação da proteínas carregadas35,36. Portanto, PSi/anos2 é um nanomaterial vantajoso para o desenvolvimento de sistemas de entrega para fatores de crescimento em geral e NGF em particular.
O trabalho atual está focado em utilizando este método como uma nova abordagem terapêutica para a administração direta de NGF para o CNS para potencial tratamento de doenças neurodegenerativas. Os portadores de2 anos de NGF-carregado podem ser implantados em cérebros de ratos e a eficácia da plataforma como implantes a longo prazo é estudado na vivo. Além disso, combinando este promissor transportadoras com não-invasiva biolistics49,50 pode habilitar um administrar as partículas de2 anos de NGF-carregado em uma resolução espacial altamente para uma área localizada usando um romance pneumático arma capilar para o tratamento de doenças neurodegenerativas, onde a administração de drogas spatiotemporal é necessária. Além disso, NGF pode direcionar o crescimento neuronal em um modo gradiente químico51, semelhantes às moléculas de orientação do axônio. Assim, os portadores de2 anos carregados podem servir como atrativo pontos quentes de NGF, para direcionar o crescimento, complementar ao outro diretor pistas52,53. Além disso, os portadores de2anos podem ser adaptados especificamente para sustentar a entrega de NGF para um período de tempo muito longo de até vários meses por mais tuning o nanostructure de2 anos e sua química de superfície.
The authors have nothing to disclose.
MS e ES reconhecer os principais serviços e suporte de Lorry I. Lokey centro para engenharia e Ciências da vida e o apoio financeiro do Instituto de nanotecnologia Russell Berrie no Technion.
Acetone | Gadot | 830101375 | |
Amphotericin | Biological Industries | 03-028-1B | |
Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
AZ4533 photoresist | Metal Chem, Inc. | AZ4533 | |
BSA fraction v | MP biomedicals | 0216006950 | |
BSA solution (10%) | Biological Industries | 03-010-1B | |
Collagen type l | Corning Inc. | 354236 | |
Collagenase | Enco | LS004176 | |
Collagen-coated plastic coverslips | NUNC Thermanox | 1059846 | |
D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich Chemicals | G8170 | |
Dispase-II | Sigma-Aldrich Chemicals | 4942078001 | |
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150073 | |
Ethanol absolute (99.9%) | Merck | 818760 | |
FBS | Biological Industries | 04-121-1A | |
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 15949 | |
Freon | Sigma-Aldrich Chemicals | 613894 | |
Guanidine-HCl | Sigma-Aldrich Chemicals | G7294 | |
Ham's F-12 nutrient mixture | Thermo Scientific | 11765054 | |
HBSS | Thermo Scientific | 14185-045 | |
HEPES (1M) | Thermo Scientific | 15630-056 | |
HS | Biological Industries | 04-124-1A | |
Human β-NGF ELISA Development Kit | Peprotech | 900-K60 | |
Immumount solution | Thermo Scientific | 9990402 | |
L-15 medium | Sigma-Aldrich Chemicals | L5520 | |
Laminin | Thermo Scientific | 23017015 | |
L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1A | |
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody | BiolLegend | SMI31P | |
Murine β-NGF | Peprotech | 450-34-20 | |
Normal donkey serum (NDS) | Sigma-Aldrich Chemicals | G9023 | |
Papain | Sigma-Aldrich Chemicals | p-4762 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | BN15710 | |
PBS (pH 7.4) | prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ). |
||
PBS X10 | Biological Industries | 02-020-1A | |
PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
Penicillin–streptomycin | Biological Industries | 03-032-1B | |
Percoll | Sigma-Aldrich Chemicals | p1644 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich Chemicals | P4832 | |
PrestoBlue reagent | Thermo Scientific | A13261 | |
RPMI medium | Biological Industries | 01-100-1A | |
Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich Chemicals | S2002 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich Chemicals | S8045 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich Chemicals | 403040 | |
Triton X-100 | Chem-Impex International Inc. | 1279 |