여기, 우리 디자인 하 고 신경 성장 인자 (NGF)에 대 한 분해 운반대로 nanostructured 다공성 실리콘 (PSi) 영화를 조작 프로토콜 제시. 신경 감 별 법 및 PC12 세포 및 마우스 지 루트 신경 절 (DRG) 뉴런의 파생물은 NGF 로드 PSi 사업자와 치료 시 특징 이다.
신경 퇴행 성 질환 치료를 위한 NGF의 위대한 잠재력에 불구 하 고 치료 관리 단백질 때문에 화학 속성, 혈액-뇌 장벽, 교차 하지 않는 중요 한 도전을 대표 하며 따라서 장기 생물 학적 효과를 뇌에 배달 합니다. 이 일이 중요 한 단백질의 지속적인 배달 NGF의 분해성 운반대로 nanostructured PSi 영화의 제작을 설명합니다. PSi 사업자는 특히 그것의 생물 학적 활동을 유지 하면서 4 주 동안 높은 로드 효능과 NGF의 지속적인 출시를 맞게 됩니다. NGF 배달 시스템으로 NGF PSi 사업자의 동작은 신경 감 별 법 및 PC12 세포와 해리 DRG 뉴런의 파생물을 유도 하는 그들의 기능을 검사 하 여 조사 생체 외에서 입니다. 단정 하 고 NGF 로드 PSi 사업자의 세포 생존 능력 평가 됩니다. PSi 통신사에서 출시 NGF의 bioactivity 반복적인 무료 NGF 행정부의 기존의 치료와 비교 됩니다. PC12 세포 분화를 분석 하 고 차별화 된 셀;의 세 가지 다른 형태학 매개 변수 측정에 의해 특징 (i) (ii) 총 neurites’ 길이 및 (iii) 분기 점의 수는 소마에서 추출 neurites의 수입니다. PC12 세포 NGF PSi 사업자로 치료 릴리스 기간 동안 깊은 차별화를 보여 줍니다. 또한, DRG 신경 세포 NGF PSi 사업자와 교양 반복적인 무료 NGF 행정부와 비슷한 신경 치료는 광범위 한 neurite 개시 표시. 공부 가변 운반대는 장기 임 플 란 트 NGF 릴리스에 대 한 신경 퇴행 성 질환에 대 한 치료 가능성을 보여 줍니다.
NGF의 개발 및 말 초 신 경계 (PNS)1 에서 뉴런의 유지 보수에 대 한 필수적 이며 중앙 신경 시스템 (CNS)2에서 생존 및 기저 개 해 신경의 기능에 중요 한 역할. 중앙 신경 퇴행 성 질환, 알츠하이머병, 파 킨 슨 병, 등 치료에 대 한 높은 약리 잠재력 널리 입증 되었습니다, 진행3,,45, 현재 임상 시험으로 6. CNS에 NGF의 전달에 가장 큰 도전 (BBB), 체계적으로 관리 될 때7혈액 두뇌 방 벽을 교차 하는 그것의 무 능력에 있는. 또한, NGF 민감성 급격 한 효소 저하에 그것의 짧은 반감기를 렌더링 하 고 크게 제한 하는 그것의 치료 사용8,9. 따라서, NGF의 연장과 제어 릴리스 안전한 방식으로 허용 하는 전달 시스템을 설계 하는 충족 되지 도전이 이다. 폴리머 기반 시스템을 포함 한 다양 한 NGF 전달 시스템 되었습니다 공부10,11,12,13,,1415, 16 , 17. 이러한 시스템의 릴리스 프로필 종종 별개 초기 버스트 어디 후자 단계에서 릴리스 율은 초기 버스트11 에 비해 크게 낮은 느린 연속 방출 다음 특징 이었다 ,1819. 또한, 캡슐화 과정 (예를 들어, poly(lactic-co-glycolic) 산) 고분자의 산 성 저하 제품 또는 NGF bioactivity의 손실에 의해 단백질의 비활성화는 시스템20이 관찰 되었다.
Nanostructured PSi는 유망 약물 전달 플랫폼21, predestining 체액에는 높은 표면적, 다공성 대용량, 생체 적합성, 및 가변 분해성을 포함 한 몇 가지 매력적인 속성에 의해 특징입니다. 22,23,,2425,26,27,28. 그 양극의 적절 한 선택 쉽게 마약 로드 및 릴리스 속도 론21,27조정에 대 한 PSi 구조 속성 (예를 들면, 다공성 및 기 공 크기)를 조정할 수 있습니다. 또한, 다양 한 편리한 화학 노선 PSi의 표면 수정 및 그 추가 조정 시 비 계 생리 적 조건 하에서 해산 속도 약22,24의 출시 속도를 허용합니다 29,30.
이 작품은 NGF의 장기간 제어 릴리스 PSi 기반 배달 시스템 설계에 집중 한다. 신경 감 별 법 및 파생물 NGF PSi 캐리어의 효과 PC12 세포를 사용 하 여 검사 및 DRG 뉴런 해리. 우리는 로드 NGF neurite 결과 단일 관리 내에서 1 개월 출시 기간 동안 깊은 차별화를 유도 하 여 그것의 bioactivity를 유지 하고있다 보여줍니다.
분해성 nanostructured PSiO2 영화는 날조 고 NGF의 생물 활성을 유지 하는 동안 지속적이 고 장시간 출시에 대 한 허용에 대 한 사업자로 서. NGF에 대 한 배달 시스템으로 역할을 PSiO2 의 잠재력 충분 한 NGF 복용량 신경 분화 유도 및 홍보 PC12 세포와 DRG 뉴런의 파생물을 출시 그들의 능력을 입증 함으로써 생체 외에서 설명 했다. 설계 된 영화는 미래의 치료 비보에 대 한 NGF의 장기 저수지로 사용할 수 있습니다.
조작된 PSi 영화의 구조적 속성 NGF 페이로드; 구체적으로 맞게 했다 전기 화학 에칭 과정의 전류 밀도 약 40의 기 공 크기를 조정 했다 NGF,33~ 4 nm 특성 직경 26.5 kDa32 의 molecular weight와 단백질을 쉽게 수용할 것 nm 다공성 매트릭스 내. 또한, 다공성 발판의 열 산화 NGF의 물리적 흡착 수 있도록 부정 청구 산화 PSi 표면에 충전 된 단백질의 정전기 매력에 의해 수행 되었다. PSi의 표면 화학 로드 효능에 큰 효과 발휘 하 고 더 나은 페이로드 및 다공성 매트릭스 사이의 상호 작용을 제어 하기 위해 쉽게 조정 될 수 있다. 이러한 상호 작용은 이후에 흡착된 단백질 분자의 구조와 그들의 bioactivity34,,3536을 지정합니다. 결론적으로, 시스템 적절 한 기 공 크기, 표면 특성 및 용 매와 언급 한 매개 변수 지정의 효과 단백질 로드 로드 이상 신중 하 게 선택 하 여 NGF의 최적의 로드를 조정 했다 효능입니다. 따라서, 표면 화학 제조 매개 변수 (예를 들면, 전류 밀도, 에칭 시간, 유형 및 불순물 또는 전해질의 농도), 변경 또는 솔루션 구성 로드 로드 효능과의 bioactivity에 영향을 미칠 수 있는 로드 된 단백질입니다.
PSi orPSiO2호스트에서 페이로드의 출시 속도 일반적으로 두 개의 동시 메커니즘, 페이로드 분자의 아웃 확산과 시 비 계37의 저하의 조합에 의해 결정 됩니다. 침식과 후속 해산 속도 이식 사이트, 그것의 병 리 및 질병 상태28,38,39에 의해 영향을 받습니다. 그것은 이전 작업에는 다른 방출 속도 특정 치료 응용 프로그램에 필요한 경우 릴리스 프로필 수정 고 수 PSi 표면38,40의 표면 화학을 변경 하 여 연장 설립 41. PSi 표면 안정화의 저하 및 필연적인 페이로드 릴리스35,42 영향을 다양 한 화학 수정, 열 산화, 열 탄 등 hydrosilylation 기술, 보였다 ,43,,4445. 또한, 다양 한 표면 화학 경로 통해 시 비 계 단백질 분자의 화학식 첨부 하 여 사업자에 NGF의 로드 초래 한다 더 장기간된 릴리스 때 공유 결합이 페이로드 릴리스입니다만 있기 때문에 나는 매트릭스는 Si 지원21저하.
또한, 그것의 제조 공정에 따라 PSi 렌더링할 수 미46, 나노47 등 무료 서 막26, 사업자로 서도 사용할 수 있는 얇은 필름 외 다양 한 구성으로 NGF와만 나 특정 응용 프로그램 요구.
임상 관련 있을, PSiO2 사업자 내에서 NGF 콘텐츠 치료 복용량의 범위가 되어야만 합니다. 프로토콜에서 설명 하는 방법을에서 NGF 로드 PSiO2 사업자 셀 미디어의 2 mL의 일관 된 볼륨에 소개 또는 PBS 버퍼 및 따라서, 로딩 솔루션 및 각각 NGF 대량 로드의 농도를 조정 했다는 NGF 농도를 시험 생체 외에서 시스템에 대 한 관련 된 발표 했다. 다른 시스템, 전 비보 비보에 환경,이 방법을 활용 하면 솔루션을 로드 NGF의 농도 증가 고 필요한 복용량에 따라 조정 해야 합니다. 또는, 높은 NGF 콘텐츠 테스트 영역 당 여러 항공사를 도입 하 여 또는 PSiO2 샘플의 더 큰 영역을 사용 하 여 얻을 수 있습니다.
또한, 출시 기간 따라 나중 시간 포인트에서 릴리스 NGF 농도가 이전 시간 포인트에서 보다 훨씬 낮은는 주목 한다. NGF 플럭스는 시간이 지남에 따라 일정 하지 않은 사실은 응용 프로그램 요구에 따라 시스템을 설계할 때 고려 사항으로 기울여야 합니다.
수많은 NGF 배달 시스템 개발 되 고 문학, 그들의 대부분에는 폴리머 기반 시스템,10,11,,1215 변화 합성 또는 천연 폴리머의 구성 , 16 , 그러나 17.이 시스템은 효과적인 나타났습니다 지속적인된 출시 프로 파일,, 중요 한 폭발 효과 함께 몇 일의 기간 동안 스팬 릴리스 기간. 이러한 전송 플랫폼의 일부 캡슐화 과정, 다른 안정화 에이전트18,48, 뿐만 아니라 정교 하 고 복잡 한의 사용 요구에 따라 bioactivity의 손실과 같은 중요 한 한계에서 고통 제조 기법16. 단백질을 위한 전달 시스템 설계에 가장 큰 과제 중 하나 캐리어 시스템 내 함정에 분자의 bioactivity를 유지 하는 기능입니다. PSi/PSiO2 RT 또는 낮은 온도에 단백질 또는 펩 티 드 이러한 민감한 생체를 로드할 때 모두 중요 한 요소는 강한 유기 용 매를 사용 하지 않고 로드할 수 있습니다. 이전 학문은 PSi/PSiO2 표면 화학 로드 단백질35,36의 가능한 변성을 최소화에 있는 중요 한 역할을 설명 했다. 따라서 PSi/PSiO2 는 특히 일반적 성장 요인에 대 한 전달 시스템을 개발 하 고 NGF 유리한 접한 이다.
현재 작업은 신경 퇴행 성 질환의 잠재적인 치료에 대 한 CNS에 NGF의 직접 관리에 대 한 새로운 치료 방법으로이 방법을 활용에 초점. NGF 로드 PSiO2 사업자는 쥐 두뇌에서 이식 될 수 이며 장기 이식으로 플랫폼의 효능 공부 vivo에서. 또한, 비-침략 적 biolistics49이 유망 사업자 결합,50 수 수 있게 소설 공기를 사용 하 여 지역화 된 영역을 높은 해상도에서 NGF 로드 PSiO2 입자 관리 모 세관 총 spatiotemporal 약국이 필요한 신경 퇴행 성 질환 치료를 위한. 또한, NGF는 화학 그라데이션 방식으로51, 축 삭 지도 분자와 비슷한 신경 성장 보낼 수 있습니다. 따라서, 로드 PSiO2 캐리어 유인 핫스팟 NGF, 성장, 다른 감독 신호52,53를 보완 하 게 될 수 있습니다. 또한, PSiO2사업자 추가 조정 PSiO2 nanostructure 및 그것의 표면 화학 NGF의 배달 몇 개월의 시간이 훨씬 연장 기간에 대 한 유지 하기 위해 구체적으로 맞출 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
MS, ES 핵심 서비스를 인정 하 고 생명 과학 및 공학와는 Technion에서 러셀 Berrie 나노기술 연구소의 재정 지원에 대 한 트럭 I. Lokey 센터에서 지원 합니다.
Acetone | Gadot | 830101375 | |
Amphotericin | Biological Industries | 03-028-1B | |
Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
AZ4533 photoresist | Metal Chem, Inc. | AZ4533 | |
BSA fraction v | MP biomedicals | 0216006950 | |
BSA solution (10%) | Biological Industries | 03-010-1B | |
Collagen type l | Corning Inc. | 354236 | |
Collagenase | Enco | LS004176 | |
Collagen-coated plastic coverslips | NUNC Thermanox | 1059846 | |
D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich Chemicals | G8170 | |
Dispase-II | Sigma-Aldrich Chemicals | 4942078001 | |
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150073 | |
Ethanol absolute (99.9%) | Merck | 818760 | |
FBS | Biological Industries | 04-121-1A | |
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 15949 | |
Freon | Sigma-Aldrich Chemicals | 613894 | |
Guanidine-HCl | Sigma-Aldrich Chemicals | G7294 | |
Ham's F-12 nutrient mixture | Thermo Scientific | 11765054 | |
HBSS | Thermo Scientific | 14185-045 | |
HEPES (1M) | Thermo Scientific | 15630-056 | |
HS | Biological Industries | 04-124-1A | |
Human β-NGF ELISA Development Kit | Peprotech | 900-K60 | |
Immumount solution | Thermo Scientific | 9990402 | |
L-15 medium | Sigma-Aldrich Chemicals | L5520 | |
Laminin | Thermo Scientific | 23017015 | |
L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1A | |
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody | BiolLegend | SMI31P | |
Murine β-NGF | Peprotech | 450-34-20 | |
Normal donkey serum (NDS) | Sigma-Aldrich Chemicals | G9023 | |
Papain | Sigma-Aldrich Chemicals | p-4762 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | BN15710 | |
PBS (pH 7.4) | prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ). |
||
PBS X10 | Biological Industries | 02-020-1A | |
PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
Penicillin–streptomycin | Biological Industries | 03-032-1B | |
Percoll | Sigma-Aldrich Chemicals | p1644 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich Chemicals | P4832 | |
PrestoBlue reagent | Thermo Scientific | A13261 | |
RPMI medium | Biological Industries | 01-100-1A | |
Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich Chemicals | S2002 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich Chemicals | S8045 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich Chemicals | 403040 | |
Triton X-100 | Chem-Impex International Inc. | 1279 |