Здесь мы представляем протокол для проектирования и изготовления наноструктурированных пористого кремния (PSi) фильмы как разложению перевозчиков для фактора роста нервов (ФРН). После лечения с перевозчиками загружен NGF PSi характеризуются нейрональных дифференциации и нарост PC12 клеток и мышей Спинной корень нейроны ганглии (DRG).
Несмотря на большой потенциал NGF для лечение нейродегенеративных заболеваний его терапевтические администрация представляет собой значительный вызов как белок не пересекать гематоэнцефалический барьер, силу своих химических свойств и таким образом требует долгосрочного Доставка в мозг биологическое воздействие. Эта работа описывает изготовление наноструктурированных PSi фильмов как разложению носители NGF для устойчивой доставки этой чувствительной белка. PSi перевозчиков специально созданы для получения высокой загрузки эффективность и непрерывного освобождения ФРН в течение четырех недель, при сохранении своей биологической активности. Фун-PSi перевозчиков как система доставки NGF ведет расследование в пробирке путем изучения их возможность побудить нейрональных дифференциации и нарост PC12 клеток и диссоциированных нейронов DRG. Оценивается жизнеспособность клеток в присутствии аккуратным и фун загружен PSi перевозчиков. Биологическую ФРН, освобождены от перевозчиков PSi сравнивается с обычными лечения повторяющихся бесплатно NGF администраций. PC12 дифференцировки клеток, анализируется и характеризуется измерения трех различных морфологических параметров дифференцированных клеток; (i) количество невритов, извлечение из сома (ii всего невритов Длина и (iii количество точек ветвления. PC12 клетках, обработанных с перевозчиками фун-PSi продемонстрировать глубокое дифференциация на протяжении всего периода выпуска. Кроме того DRG нейрональные клетки культивировали с перевозчиками фун-PSi показывают обширные neurite посвящения, похож на нейроны лечат повторяющихся бесплатно NGF администраций. Изучал перестраиваемый перевозчиков продемонстрировать долгосрочный имплантатов для выпуска ФРН с терапевтическим потенциалом для нейродегенеративных заболеваний.
Фактор роста НЕРВОВ имеет существенно важное значение для развития и поддержания нейронов в периферической нервной системы (ПНС)1 и играет решающую роль в обеспечении выживания и функции базального переднего холинергических нейронов в центральной нервной системы (ЦНС)2. Его высокий фармакологических потенциал для лечения Центральной нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и Паркинсона, широко продемонстрировал, с клинические испытания в настоящее время прогресс3,4,5, 6. Самая большая проблема в доставке ФРН в ЦНС проживает в его неспособность пересечь гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), когда системно ведении7. Кроме того NGF восприимчивость к быстрому энзимной деградации делает его короткий период полураспада и значительно ограничивает его использование с лечебной целью8,9. Таким образом существует Невиданный вызов для разработки систем доставки, которые позволяют для продолжительного и контролируемых выпуска ФРН в безопасным способом. Различных систем доставки ФРН, включая полимерных систем, были изучены10,11,12,13,14,15, 16 , 17. выпуск профили этих систем часто характеризовались собственный первоначальный всплеск следуют медленно непрерывного освобождения, где в последней стадии выпуска составлял значительно низкими по сравнению с первоначальной взрыв11 ,18,19. Кроме того с этой системы20были замечены инактивации белка кислых продуктов распада полимеры (например, poly(lactic-co-glycolic) кислота) или утрата NGF отпорности во время процесса инкапсуляции.
Наноструктурированные PSi характеризуется несколькими привлекательными свойствами, включая его большую площадь поверхности, большой объем пористой, биосовместимость и перестраиваемые разлагаемость в жидкостях, трех его для перспективных наркотиков доставки платформы21, 22,23,24,25,26,27,28. Правильный подбор условий его анодирование позволяет легко настроить PSi структурные свойства (например, пористость и поры размер) для пошива наркотиков погрузки и выпуска кинетики21,27. Кроме того различные химические удобные маршруты позволяют изменить поверхность PSi и что далее настраивать скорость растворения Si леску в физиологических условиях и темпы выпуска препарата22,24, 29,30.
Эта работа сосредоточена на разработке системы доставки PSi для длительного контролируемого высвобождения NGF. Эффект перевозчиков фун-PSi на нейрональных дифференциации и нарост проверяется с использованием PC12 клеток и отделить DRG нейронов. Мы демонстрируем, что загружен ФРН сохранил свою биологическую, вызывая neurite нарост и глубокой дифференциации в течение периода 1-месяц выпуска в рамках единой администрации.
Разложению наноструктурированных PSiO2 пленки изготавливаются и работают в качестве носителей для ФРН, позволяющие его непрерывное и длительное выпуска, сохраняя свою биологическую активность. Потенциал PSiO2 в качестве системы доставки NGF продемонстрирован в пробирке , продемонстрировав свою способность освободить достаточно NGF дозировка побудить нейрональных дифференциации и поощрять нарост PC12 клетки и нейроны DRG. Инженерии пленки могут использоваться как долгосрочный водохранилищ NGF для будущего обращения в естественных условиях.
Структурные свойства готовых фильмов PSi были специально разработаны специально для NGF полезной нагрузки; плотность тока процесс электрохимического травления была скорректирована для получения размер пор приблизительно 40 Нм, которая бы легко разместить ФРН, белок с molecular weight 26.5 кДа32 и характерным диаметром ~ 4 Нм33, в пределах пористой матрицы. Кроме того термического окисления пористых лесов была выполнена для включения физической адсорбции NGF электростатического притяжения положительно заряженных белков на отрицательно заряженные окисленной поверхности PSi. Химии поверхности PSi оказывает значительное воздействие на эффективность загрузки и может быть легко настроен для того, чтобы лучше контролировать взаимодействие между полезной нагрузки и пористой матрицы. Эти взаимодействия впоследствии диктовать структуры адсорбированных белковых молекул и их биологическую34,35,36. В заключение система была скорректирована для получения оптимальной загрузки ФРН, тщательно выбирая соответствующий поры, характеристики поверхности и идеал, Загрузка растворителя и результирующий эффект диктует указанных параметров загрузки белка эффективность. Таким образом, любые изменения в параметрах изготовления (например, плотность тока, время травления, типа и концентрации примеси или электролита), химии поверхности или загрузки решения композиция может повлиять на эффективность загрузки и отпорности из загружен белка.
Уровень выхода полезной нагрузки от узла2orPSiO PSi обычно продиктована сочетанием двух одновременных механизмов, отток диффузии молекул полезной нагрузки и деградации лесов Si37. Эрозия и последующего распада ставка страдают от имплантации сайта, его патологии и болезни состояние28,38,39. Он был создан в предыдущей работе, что, если другой релиз скорость требуется для определенного терапевтического применения, релиз профиль может быть изменена и длительное, изменив химии поверхности PSi поверхности38,40, 41. Различные химические изменения, например термического окисления, тепловой карбонизации и hydrosilylation методы, было показано, для стабилизации поверхности PSi и влияют на его деградации и последующего грузоподъемность выпуска35,42 ,,4344,45. Кроме того, Загрузка ФРН в перевозчиков, ковалентных привязанность к Си леску через различные маршруты химии поверхности молекул белка должно привести к более длительной релиз потому, что полезная нагрузка освобождается только в тех случаях, когда ковалентные связи разрываются или Поддержка Si матрица деградации21.
Кроме того после процесса его изготовления, PSi может отображаться в различных конфигурациях помимо тонких пленок, такие как микрочастицы46, наночастицы47 или свободностоящая мембраны26, который также может использоваться в качестве перевозчиков для NGF и потребностей соответствуют конкретные приложения.
Для того чтобы быть клинически значимых, NGF содержимое в пределах2 перевозчиков PSiO должен достичь спектр терапевтических доз. В методе, указанных в протоколе, NGF загружен PSiO2 перевозчиков вводятся в последовательной объемом 2 мл ячейки СМИ или PBS буфер и, таким образом, концентрация загрузки решения и соответствующих NGF массы загруженной были скорректированы для получения выпустила NGF концентрации, которая имеет отношение к системе протестированных в пробирке . При использовании этого метода для различных систем, таких как ex vivo или в естественных условиях среды, концентрация ФРН загрузки решения следует увеличить и скорректированы с учетом необходимой дозы. Кроме того высокое содержание NGF можно получить путем введения нескольких перевозчиков в участку или использование больших областей PSiO2 образцов.
Кроме того следует отметить, что в позднее время точек вдоль период выпуска, выпущенные NGF концентрации значительно ниже, чем в более ранние моменты времени. Тот факт, что NGF потока не является постоянным с течением времени должны приниматься во внимание при проектировании системы с учетом потребностей приложения.
Многочисленные NGF доставки системы были разработаны и в литературе, большинство из них о полимерных систем, состоящих из синтетических или природных полимеров конъюгатов10,11,12,15 , 16 , 17. Эти системы показали эффективное устойчивый выпуска профилей, однако, период выпуска, занятых в течение нескольких дней с эффектом значительный пакетном. Некоторые из этих платформ доставки страдают от критических ограничений, таких как потеря отпорности процесс инкапсуляции, требующих использования различных стабилизирующих агентов18,48, а также сложные и сложные методы изготовления16. Одной из серьезных проблем в разработке систем доставки для белков является способность сохранить биологическую молекул после изобличения в системе перевозчика. Белки и пептиды могут быть загружены в PSi/PSiO2 на RT или даже при более низких температурах без использования сильных органических растворителей, которые являются как важными факторами при загрузке этих чувствительных биомолекул. Предыдущие исследования показали, что PSi/PSiO2 химии поверхности играет решающую роль в минимизации возможных денатурации загруженного белки35,36. Таким образом PSi/PSiO2 является выгодным наноматериал для разработки систем доставки для факторов роста в целом и ФРН в частности.
Текущая работа ориентирована на использование этого метода как новый терапевтический подход для прямого управления ФРН в ЦНС для потенциальных лечение нейродегенеративных заболеваний. Загружен NGF PSiO2 перевозчиков может быть имплантированы в мозг мышей и эффективность платформы как долгосрочный имплантаты учился в естественных условиях. Кроме того сочетая этот перспективный перевозчиков с неинвазивной биолистики49,50 может включить один распоряжаться загружен NGF PSiO2 частиц в весьма пространственным разрешением к локализованной области с помощью пневматических Роман капиллярные пистолет для лечение нейродегенеративных расстройств, где требуется пространственно-временных лекарствами. Кроме того NGF могут направить нейрональных рост в химической градиента образом51, аналогичны аксона ориентации молекул. Таким образом загруженного PSiO2 перевозчиков может служить в качестве приманки горячих точек для ФРН, направлять роста, дополняет другие направляющие сигналы52,53. Кроме того PSiO2перевозчиков может быть специально для поддержания доставки NGF для столь продлен срок до нескольких месяцев дальнейшие настройки PSiO2 наноструктур и его химии поверхности.
The authors have nothing to disclose.
МС и ES признать основные услуги и поддержку от центра Морозко I. грузовик жизни науки и техники и финансовой поддержке Института Рассел Berrie нанотехнологий в Технионе.
Acetone | Gadot | 830101375 | |
Amphotericin | Biological Industries | 03-028-1B | |
Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
AZ4533 photoresist | Metal Chem, Inc. | AZ4533 | |
BSA fraction v | MP biomedicals | 0216006950 | |
BSA solution (10%) | Biological Industries | 03-010-1B | |
Collagen type l | Corning Inc. | 354236 | |
Collagenase | Enco | LS004176 | |
Collagen-coated plastic coverslips | NUNC Thermanox | 1059846 | |
D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich Chemicals | G8170 | |
Dispase-II | Sigma-Aldrich Chemicals | 4942078001 | |
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150073 | |
Ethanol absolute (99.9%) | Merck | 818760 | |
FBS | Biological Industries | 04-121-1A | |
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 15949 | |
Freon | Sigma-Aldrich Chemicals | 613894 | |
Guanidine-HCl | Sigma-Aldrich Chemicals | G7294 | |
Ham's F-12 nutrient mixture | Thermo Scientific | 11765054 | |
HBSS | Thermo Scientific | 14185-045 | |
HEPES (1M) | Thermo Scientific | 15630-056 | |
HS | Biological Industries | 04-124-1A | |
Human β-NGF ELISA Development Kit | Peprotech | 900-K60 | |
Immumount solution | Thermo Scientific | 9990402 | |
L-15 medium | Sigma-Aldrich Chemicals | L5520 | |
Laminin | Thermo Scientific | 23017015 | |
L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1A | |
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody | BiolLegend | SMI31P | |
Murine β-NGF | Peprotech | 450-34-20 | |
Normal donkey serum (NDS) | Sigma-Aldrich Chemicals | G9023 | |
Papain | Sigma-Aldrich Chemicals | p-4762 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | BN15710 | |
PBS (pH 7.4) | prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ). |
||
PBS X10 | Biological Industries | 02-020-1A | |
PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
Penicillin–streptomycin | Biological Industries | 03-032-1B | |
Percoll | Sigma-Aldrich Chemicals | p1644 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich Chemicals | P4832 | |
PrestoBlue reagent | Thermo Scientific | A13261 | |
RPMI medium | Biological Industries | 01-100-1A | |
Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich Chemicals | S2002 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich Chemicals | S8045 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich Chemicals | 403040 | |
Triton X-100 | Chem-Impex International Inc. | 1279 |