Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu entwerfen und fabrizieren nanostrukturierten poröse Silizium (PSi) Filme als abbaubare Träger für den Nervenwachstumsfaktor (NGF). Neuronale Differenzierung und Auswuchs der PC12 Zellen und Mäusen Dorsal Root Ganglion (DRG) Neuronen sind bei der Behandlung mit der NGF geladen PSi Träger gekennzeichnet.
Trotz des großen Potenzials des NGF zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen seine therapeutischen Verwaltung stellt eine große Herausforderung dar, da das Protein nicht die Blut – Hirn-Schranke, aufgrund seiner chemischen Eigenschaften überquert und erfordert daher langfristige Lieferung an das Gehirn, um eine biologische Wirkung haben. Diese Arbeit beschreibt Herstellung von nanostrukturierten PSi Filme als abbaubare Träger der NGF für nachhaltige Lieferung dieses sensiblen Proteins. Die PSi-Träger sind speziell auf um hohe Beladung Wirksamkeit und kontinuierliche Freisetzung von NGF für einen Zeitraum von vier Wochen, wobei seine biologischen Aktivität zu erhalten. Das Verhalten der NGF-PSi Träger als ein NGF-Delivery-System ist untersuchten in Vitro anhand ihrer Fähigkeit, neuronale Differenzierung und Auswuchs der PC12 Zellen und dissoziierten DRG-Neuronen zu induzieren. Zellviabilität im Beisein ordentlich und NGF geladen PSi Träger wird ausgewertet. Die Bioaktivität der NGF freigesetzt von den PSi-Trägern ist im Vergleich zu der konventionellen Behandlung der sich wiederholenden kostenlose NGF Verwaltungen. PC12 Zelldifferenzierung analysiert und charakterisiert durch die Messung der drei verschiedenen morphologischen Parametern von differenzierten Zellen; (i) die Anzahl der Neuriten extrahieren aus der Soma (Ii) die gesamten Neuriten Länge und (Iii) die Anzahl der Verzweigungspunkten. PC12 Zellen behandelt mit den NGF-PSi-Trägern zeigen eine tiefe Differenzierung während der gesamten Release. Darüber hinaus zeigen DRG neuronale Zellen kultiviert mit NGF-PSi-Träger einer umfangreiche Neuriten Initiation mit sich wiederholenden kostenlose NGF Verwaltungen Neuronen ähnlich behandelt. Die untersuchten abstimmbaren Träger zeigen die langfristigen Implantate für die NGF Release mit einem therapeutischen Potenzial für Neurodegenerative Erkrankungen.
NGF ist essentiell für die Entwicklung und Wartung von Neuronen im peripheren Nervensystem (PNS)1 und spielt eine entscheidende Rolle in das Überleben und die Funktion der basalen Vorderhirn cholinerge Neuronen im zentralen Nervensystem (ZNS)2. Seine pharmakologische hohe Potenzial für die Behandlung von zentralen Neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson, wurde allgemein mit klinischen Studien derzeit im Fortschritt3,4,5nachgewiesen, 6. Die größte Herausforderung bei der Bereitstellung von NGF an die CNS wohnt in seiner Unfähigkeit, die Blut-Hirn-Schranke (BBB), wenn Sie systemisch verabreicht7. Darüber hinaus NGF Anfälligkeit für schnelle enzymatische Abbau macht seiner kurze Halbwertszeit und deutlich begrenzt seine therapeutische Verwendung8,9. Daher ist eine unbefriedigte Herausforderung, Delivery-Systeme zu entwerfen, die für eine längere und kontrollierte Freisetzung von NGF auf sichere Weise zu ermöglichen. Verschiedenen NGF-Delivery-Systeme, einschließlich der Polymer-basierten Systemen wurden studierte10,11,12,13,14,15, 16 , 17. die Veröffentlichung Profile dieser Systeme zeichneten sich oft durch eine ausgeprägte ersten Ausbruch folgte durch eine langsame kontinuierliche Freisetzung, wo in der zweiten Stufe die Freisetzungsrate erheblich geringer im Vergleich zu den ersten Ausbruch11 ,18,19. Darüber hinaus wurden die Inaktivierung des Proteins durch die sauren Abbauprodukte der Polymere (z.B., poly(lactic-co-glycolic) Säure) oder Verlust der NGF Bioaktivität bei der Kapselung mit dieser Systeme20beobachtet.
Nanostructured PSi zeichnet sich durch mehrere ansprechende Eigenschaften, wie hohe Fläche, poröse großvolumige, Biokompatibilität und abstimmbaren Abbaubarkeit in Körperflüssigkeiten, für eine viel versprechende Medikamente Lieferung Plattform21wachsenden, 22,23,24,25,26,27,28. Richtige Auswahl der Anodisierung Bedingungen kann mühelos die PSi strukturellen Eigenschaften (z.B., Porosität und Pore Größe) für Schneiderei Medikament be- und Freigabe Kinetik21,27einstellen. Darüber hinaus erlauben bequeme chemische Wanderrouten, ändern Sie die Oberfläche des PSi und damit weiter optimieren die Auflösegeschwindigkeit Si Gerüst unter physiologischen Bedingungen und die Freisetzungsraten der Droge22,24, 29,30.
Diese Arbeit konzentriert sich auf eine PSi-basiertes Liefersystem für längere kontrollierte Freisetzung von NGF zu entwerfen. Die Wirkung der NGF-PSi Träger auf neuronale Differenzierung und Auswuchs wird mit PC12 Zellen untersucht und DRG-Neuronen zu trennen. Wir zeigen, dass die geladenen NGF die Bioaktivität bewahrt hat, durch Induktion Neuriten Auswuchs und Tiefe Differenzierung über einen 1-Monats-Zeitraum innerhalb einer einzigen Verwaltung.
Abbaubare nanostrukturierten orientierter2 Filme sind hergestellt und als Träger für NGF, so dass für seine kontinuierliche und verlängerte Freigabe, seine biologischen Aktivität unter Beibehaltung eingesetzt. In Vitro demonstriert das Potenzial der Beteiligte2 , dienen als ein Fördersystem für NGF ist durch den Nachweis ihrer Fähigkeit zur Freigabe ausreichend NGF Dosierung induzieren neuronale Differenzierung und Förderung Auswuchs der PC12 Zellen und DRG-Neuronen. Die entwickelten Filme dient als langfristige Stauseen von NGF für zukünftige Behandlung in Vivo.
Die strukturellen Eigenschaften der gefertigten PSi Filme wurden speziell für NGF Nutzlast zugeschnitten; die Stromdichte von der elektrochemischen Ätzvorgang wurde angepasst, um Porengröße ca. 40 erhalten nm, die leicht, wenn der NGF, ein Protein mit einer Molecular weight von 26,5 kDa32 und einen charakteristischen Durchmesser von ~ 4 nm33 berücksichtigen würde, innerhalb der poröse Matrix. Darüber hinaus wurde thermische Oxidation des porösen Gerüstes durchgeführt, um physikalische Adsorption von NGF ermöglichen durch elektrostatische Anziehung des positiv geladenen Proteins, die negativ geladenen oxidierte PSi-Oberfläche. Die Oberflächenchemie der PSi übt einen großen Einfluss auf die Wirksamkeit laden und kann leicht eingestellt werden, um die Wechselwirkungen zwischen der Nutzlast und der poröse Matrix besser kontrollieren. Diese Wechselwirkungen bestimmen anschließend die Struktur der adsorbierten Protein-Moleküle und deren Bioaktivität34,35,36. Abschließend wurde das System angepasst, um optimale Beladung von NGF zu erhalten durch eine sorgfältige Auswahl der geeignete Porengröße, Oberflächeneigenschaften und der ideale laden Lösungsmittel und der daraus resultierende Effekt der genannten Parameter diktiert das Protein-laden Wirksamkeit. Daher Änderungen in der Fertigung-Parameter (z.B., Stromdichte, Radierung Zeit, Art und Konzentration der Dotierstoff oder Elektrolyt), Oberflächenchemie oder laden Lösung Zusammensetzung beeinflussen kann, die Belastung Wirksamkeit und Bioaktivität von der geladene Protein.
Die Freisetzungsrate eine Nutzlast von PSi OrPSiO2Host ist in der Regel durch eine Kombination von zwei gleichzeitigen Mechanismen, out Diffusion von der Nutzlast-Molekülen und den Abbau der Si Gerüst37diktiert. Die Erosion und anschließende Auflösungsgeschwindigkeit sind Implantationsort, der Pathologie und Krankheit Staat28,38,39betroffen. In früheren Arbeiten wurde festgestellt, dass wenn eine unterschiedliche Freisetzungsrate für eine bestimmte therapeutische Anwendung erforderlich ist, kann das Freisetzungsprofil geändert und verlängert durch Ändern der Oberflächenchemie der PSi Oberfläche38,40, 41. Verschiedene chemische Modifikationen, wie thermische Oxidation, thermische Karbonisierung und Hydrosilylierung Techniken haben gezeigt, dass die PSi-Oberfläche zu stabilisieren und beeinflussen seine Degradierung und daraus resultierende Nutzlast Freigabe35,42 ,43,44,45. Darüber hinaus sollten Laden der NGF in den Trägern durch kovalente Bindung die Proteinmoleküle an Si Gerüst über verschiedene Wege der Oberflächenchemie in einer längeren Version führen, da die Nutzlast nur freigegeben wird, wenn die kovalente Bindungen gebrochen sind oder die Unterstützung von Si-Matrix ist abgebaut,21.
Darüber hinaus kann im Anschluss an den Fertigungsprozess PSi gerendert werden in verschiedenen Konfigurationen neben Dünnfilme, z. B. Mikropartikel46, Nanopartikel47 oder freistehende Membranen26, die auch als Träger eingesetzt werden können NGF und erfüllen spezifische Anwendungsanforderungen.
Um klinisch relevant zu sein, sollte der NGF Inhalt innerhalb der Beteiligte2 Träger die Reichweite von therapeutischen Dosen. In der im Protokoll beschriebenen Methode die NGF geladen orientierter2 Träger in eine einheitliche Lautstärke von 2 mL der Zelle Medien eingebracht werden oder PBS-Puffer und damit die Konzentration der Laden-Lösung und die jeweiligen NGF Masse geladen wurden angepasst, um die Ausbeute eines NGF-Konzentration, die relevant für das getestete in-Vitro -System veröffentlicht. Bei der Verwendung dieser Methode für verschiedene Systeme, wie z. B. Ex Vivo oder in-Vivo -Umgebungen, sollte die Konzentration der NGF laden Lösung erhöht und die benötigte Dosis angepasst. Alternativ kann höhere NGF Inhalt durch die Einführung mehrerer Träger pro geprüften Bereich oder über größere Flächen orientierter2 Proben einzuholen.
Darüber hinaus ist darauf hinzuweisen, dass in späteren Zeitpunkten entlang der Freigabedauer, die freigegebenen NGF-Konzentrationen deutlich niedriger als bei früheren Zeitpunkten sind. Die Tatsache, dass der NGF-Fluss im Laufe der Zeit nicht konstant ist muss berücksichtigt werden, wenn das System nach Anwendung Bedürfnissen entwerfen.
Zahlreiche NGF Lieferung Systeme wurden entwickelt und beschrieben, die meisten von ihnen sind Polymer-basierten Systemen, bestehend aus synthetischen oder natürlichen Polymeren Konjugate10,11,12,15 , 16 , 17. diese Systeme haben gezeigt, wirksam verzögerter Freisetzung Profile jedoch die Freigabedauer erstreckte sich über einen Zeitraum von mehreren Tagen mit einem erheblichen Burst-Effekt. Einige dieser Lieferung Plattformen leiden unter kritischen Einschränkungen z. B. Verlust der Bioaktivität auf die Kapselung Prozess, der Nutzung der verschiedenen stabilisierenden Agenten18,48, sowie anspruchsvolle und komplexe Fertigung-Techniken-16. Eine der größten Herausforderungen bei der Entwicklung von Trägersystemen für Proteine ist die Fähigkeit, die Bioaktivität der Moleküle bei Einschluss in die Carrier-System zu erhalten. Proteine oder Peptide können geladen werden in PSi/beteiligte2 bei RT oder auch bei niedrigeren Temperaturen ohne starke organische Lösungsmitteln, die beide wichtigen Faktoren sind, wenn diese empfindlichen Biomoleküle zu laden. Frühere Studien haben gezeigt, dass PSi/beteiligte2 Oberflächenchemie eine entscheidende Rolle spielt bei der Minimierung von möglichen Denaturierung von den geladenen Proteine35,36. PSi/beteiligte2 ist daher, insbesondere eine vorteilhafte Nanomaterialien für die Entwicklung von Trägersystemen für Wachstumsfaktoren im allgemeinen und NGF.
Die derzeitige Arbeit konzentriert sich auf die Verwendung dieser Methode als einen neuen therapeutischen Ansatz für die direkte Verwaltung der NGF in das ZNS für potenzielle Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen. Die NGF geladen orientierter2 Träger in den Gehirnen der Mäuse implantiert werden können und die Wirksamkeit der Plattform als langfristige Implantate ist studierte in Vivo. Darüber hinaus kann Kombination von diesen vielversprechenden Träger mit nicht-invasiven Biolistics49,50 die NGF geladen orientierter2 Partikel in eine hohe räumliche Auflösung zu einem lokalisierten Bereich mit einem pneumatischen Roman verwalten ermöglichen Kapillare Waffe zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, denen eine räumlich-zeitliche Medikamentengabe erforderlich ist. Darüber hinaus kann NGF neuronale Wachstum in einem chemischen Gradienten Weise51, ähnlich wie Axon Guidance Moleküle leiten. Somit können die geladene beteiligte2 Träger als Lockstoff-Hot-Spots zu NGF, Wachstum, ergänzend zu anderen Regie Cues52,53direkt dienen. Darüber hinaus können beteiligte2Träger speziell zugeschnitten werden, um die Lieferung von NGF für eine viel verlängert Frist von bis zu mehreren Monaten aufrecht zu erhalten, durch weitere tuning-orientierter2 Nanostruktur und ihrer Oberflächenchemie.
The authors have nothing to disclose.
MS und ES bestätigen die Kernleistungen und Unterstützung vom LKW I. Lokey Zentrum für Life Science und Engineering und die finanzielle Unterstützung des Instituts Russell Berrie Nanotechnologie am Technion.
Acetone | Gadot | 830101375 | |
Amphotericin | Biological Industries | 03-028-1B | |
Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
AZ4533 photoresist | Metal Chem, Inc. | AZ4533 | |
BSA fraction v | MP biomedicals | 0216006950 | |
BSA solution (10%) | Biological Industries | 03-010-1B | |
Collagen type l | Corning Inc. | 354236 | |
Collagenase | Enco | LS004176 | |
Collagen-coated plastic coverslips | NUNC Thermanox | 1059846 | |
D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich Chemicals | G8170 | |
Dispase-II | Sigma-Aldrich Chemicals | 4942078001 | |
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150073 | |
Ethanol absolute (99.9%) | Merck | 818760 | |
FBS | Biological Industries | 04-121-1A | |
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 15949 | |
Freon | Sigma-Aldrich Chemicals | 613894 | |
Guanidine-HCl | Sigma-Aldrich Chemicals | G7294 | |
Ham's F-12 nutrient mixture | Thermo Scientific | 11765054 | |
HBSS | Thermo Scientific | 14185-045 | |
HEPES (1M) | Thermo Scientific | 15630-056 | |
HS | Biological Industries | 04-124-1A | |
Human β-NGF ELISA Development Kit | Peprotech | 900-K60 | |
Immumount solution | Thermo Scientific | 9990402 | |
L-15 medium | Sigma-Aldrich Chemicals | L5520 | |
Laminin | Thermo Scientific | 23017015 | |
L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1A | |
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody | BiolLegend | SMI31P | |
Murine β-NGF | Peprotech | 450-34-20 | |
Normal donkey serum (NDS) | Sigma-Aldrich Chemicals | G9023 | |
Papain | Sigma-Aldrich Chemicals | p-4762 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | BN15710 | |
PBS (pH 7.4) | prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ). |
||
PBS X10 | Biological Industries | 02-020-1A | |
PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
Penicillin–streptomycin | Biological Industries | 03-032-1B | |
Percoll | Sigma-Aldrich Chemicals | p1644 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich Chemicals | P4832 | |
PrestoBlue reagent | Thermo Scientific | A13261 | |
RPMI medium | Biological Industries | 01-100-1A | |
Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich Chemicals | S2002 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich Chemicals | S8045 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich Chemicals | 403040 | |
Triton X-100 | Chem-Impex International Inc. | 1279 |