豊かにし、磁性ナノ粒子でまれな抗原特異的 T 細胞を展開
Summary
抗原特異的 T 細胞は特性またはその極低周波による治療を利用しにくい。本明細書で我々 はこれらの細胞を豊かにする抗原特異的 T 細胞に結合することができます磁性粒子を開発するためのプロトコルを提供し、それらをいくつか展開する特性評価および治療の両方の 100 倍。
Abstract
両方豊かにし、抗原特異的 T 細胞を拡大するツールを開発しました。これは A) 抗原特異的 T 細胞の存在を検出、B) 抗原特異的応答のダイナミクスのプローブ、C) を理解するよう場合に有用することができます抗原特異的応答など自己免疫疾患の状態に影響を与える、どのように D) 分かり異種抗原特異的 T 細胞、または E の応答) は、抗原特異的細胞療法を利用します。ツールは、抗原特異的および T 細胞共刺激シグナルを共役我々 ことと人工抗原提示細胞 (aAPCs) として長期的に磁性粒子に基づいています。その結果、技術は生成に簡単です、のでそれが簡単に採用される; 他の所でしたがって、本研究の目的は作製と、aAPCs の後の使用について詳しく説明します。我々 は、aAPCs に特定の抗原、共刺激シグナルを添付する方法、抗原特異的 T 細胞を豊かにするそれらを活用する方法と抗原特異的 T 細胞を拡張する方法について説明します。さらに、我々 は設計の考慮事項は、抗原特異的 T 細胞を特徴と私たちの経験の実験的および生物学的情報に基づくを強調表示されます。
Introduction
多くの免疫療法の上昇、特性し、免疫応答を制御することができる必要があります。特に、適応免疫応答は、関心の特異性とセルの耐久性のためです。最近では、キメラ抗原受容体の T 細胞療法がん治療として承認されましたしかし、抗原受容体は、がん1に固有の抗原ではなくに一般的な細胞表面抗原 CD19、オフに基づいています。を超えて、特異性免疫療法もコントロール、および限られたがんや自己免疫疾患に免疫応答を理解の欠如から苦しむことができます。
抗原特異的応答の研究の課題の一つは、超低周波、 e.g。、抗原特異的 T 細胞がすべての 10 の 14 106 T 細胞2,3。したがって、T を調査する細胞が存在または応答して、セルを充実・拡大し、する必要がありますまたはその信号を増幅する必要があります。高価、抗原特異的細胞の拡大に焦点を当てた現在の技術を使用してフィーダー細胞を維持することは困難です。抗原特異的 T の信号増幅に焦点を当てた現在の技術細胞、酵素 immunospot (しなさい) 試金のようなこれらの T 細胞4の再利用を制限します。最後に、感度が低いためしばしばこれらの 2 つの手法組み合わせることが必要抗原特定の列挙。
これらの問題に対処するため、磁性ナノ粒子を用いた人工抗原提示細胞 (aAPC)5,6,7、8を開発しました。AAPC は抗原特異的信号ペプチド ロード主要組織適合遺伝子複合体 (pMHC) と共刺激分子修飾することができます例えば、抗 CD28 抗体-抗原特異的 T 細胞を豊かにし、その後。(図 1) の拡大を刺激します。粒子は、抗原特異的刺激に合わせてカスタマイズまだ実験と患者全体で標準化することができますコスト効果の高い市販製品をすることができます。濃縮および拡張を実行する抗原特異的 cd 8 + T 細胞の数千倍の拡大に何百もの結果の処理、周波数で起因できる特性や大型の治療上の使用を有効にするちょうど 1 週間後に 60%セルの数。ここ、ナノ粒子 aAPCs、ナノ粒子のプロパティを選択する際にいくつかの重要な設計の考慮事項を確認する方法について説明し、これらの粒子を分離すると、希少な抗原特異的 cd 8 + T 細胞の拡大を利用してからいくつかの典型的な結果を示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々 は、ナノ人工抗原提示細胞 (aAPCs) に基づく新規抗原特異的 T 細胞の分離技術を作成しています。ナノ粒子 aAPCs ペプチド-読み込まれている MHC 抗原特異的 T 細胞のバインディングとアクティベーション共刺激活性化と一緒にことができる表面に。aAPCs は、常磁性、また、したがって磁場を用いた希少な抗原特異的 T 細胞を豊かにするために使用できます。我々 は最適化し、キー ナノ粒子…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.W.H. は、ナノバイオ テクノロジー、国立科学財団大学院研究員 (DGE-1232825) と交わりを支える円弧財団のジョンズ ・ ホプキンズ大学で NIH がんナノテクノロジー トレーニング センターを感謝します。この作品は、コールター財団 (JPS)、テッドコー/メリーランド州イノベーション イニシアチブ健康の国民の協会 (P01-AI072677、R01-CA108835、R21-CA185819) からの支援によって賄われていた。
Materials
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 551263 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig | BD Biosciences | 551323 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 550750 | |
| Vivaspin 20 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932362 | |
| Vivaspin 2 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932257 | |
| Purified Human Beta 2 Microglobulin | Bio-Rad | PHP135 | |
| nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles | Micromod | 79-01-102 | |
| Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm | Ocean Nanotech | SN0200 | |
| Anti-Biotin MicroBeads UltraPure | Miltenyi | 130-105-637 | |
| EZ-Link NHS-Biotin | ThermoFisher | 20217 | |
| Sulfo-SMCC Crosslinker | ProteoChem | c1109-100mg | |
| 2-Iminothiolane hydrochloride | Sigma-Aldrich | I6256 Sigma | |
| 96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene | Corning | 3875 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain Clone R26-46 | BD Biosciences | 553434 | |
| FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG Clone G192-1 | BD Biosciences | 554026 | |
| B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice | Jackson Laboratory | 005023 | |
| C57BL/6J (B6 wildtype) mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse | Miltenyi | 130-104-075 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE | Biolegend | 405203 | |
| N52 disk magnets of 0.75 inches | K&J Magnetics | DX8C-N52 | |
| APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 | Biolegend | 100711 | |
| LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation | ThermoFisher | L-34969 |
References
- Prasad, V. immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11 (2018).
- Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. The Journal of Immunology. 188 (9), 4135-4140 (2012).
- Rizzuto, G. A., et al. Self-antigen-specific CD8+ T cell precursor frequency determines the quality of the antitumor immune response. Journal of Experimental Medicine. 206 (4), 849-866 (2009).
- Newell, E. W., Davis, M. M. Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells. Nature biotechnology. 32 (2), 149 (2014).
- Perica, K., et al. Enrichment and expansion with nanoscale artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy. ACS nano. 9 (7), 6861-6871 (2015).
- Kosmides, A. K., Necochea, K., Hickey, J. W., Schneck, J. P. Separating T Cell Targeting Components onto Magnetically Clustered Nanoparticles Boosts Activation. Nano Letters. , (2018).
- Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation. Nano Letters. 17 (11), (2017).
- , ., et al. Efficient magnetic enrichment of antigen-specific T cells by engineering particle properties. Biomaterials. , (2018).
- Oelke, M., et al. Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy. Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).
- Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care. Journal of visualized experiments: JoVE. (96), (2015).
- Ho, W. Y., Nguyen, H. N., Wolfl, M., Kuball, J., Greenberg, P. D. In vitro methods for generating CD8+ T-cell clones for immunotherapy from the naive repertoire. Journal of immunological methods. 310 (1-2), 40-52 (2006).
- Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII. 57 (2), 175-183 (2008).
- Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1. Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).
- Castle, J. C., et al. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).
- Duan, F., et al. Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity. Journal of Experimental Medicine. 211 (11), 2231-2248 (2014).
- Srivastava, P. K., Duan, F. Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).
- Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572 (2014).
- Gros, A., et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients. Nature medicine. 22 (4), 433 (2016).
