إثراء وتوسيع نطاق خلايا نادرة محددة مستضد تي مع جسيمات نانوية مغناطيسية
Summary
محددة مستضد خلايا تي من الصعب أن تميز أو تستخدم في العلاج بسبب هذه الغاية منخفضة التردد. هنا، نحن نقدم بروتوكول لتطوير جسيمات مغناطيسية التي يمكن ربط محددة مستضد خلايا تي لإثراء هذه الخلايا ومن ثم توسيعها عدة عف لتوصيف والعلاج على حد سواء.
Abstract
قمنا بتطوير أداة لكل من إثراء وتوسيع نطاق خلايا تي حدة مستضد. وهذا يمكن أن يكون مفيداً في حالات مثل A) الكشف عن وجود خلايا تي مستضد على حدة، ب) التحقيق في ديناميات استجابات محددة مستضد، ج) فهم كيف تؤثر ردود محددة مستضد على حالة المرض مثل المناعة الذاتية، د) الغموض غير متجانسة استخدام استجابات محددة مستضد خلايا تي، أو ه) محددة مستضد الخلايا للعلاج. الأداة تستند جسيمات مغناطيسية نحن متزاوجة مستضد على حدة وإشارات الخلية تي كوستيمولاتوري، ونحن المدى مصطنعة مستضد تقديم الخلايا (آبكس). ونتيجة لذلك، ولما بسيطة لإنتاج التكنولوجيا، يمكن بسهولة يتم اعتماده بمختبرات أخرى؛ وهكذا، هدفنا هنا لوصف بالتفصيل بتصنيع واستخدام اللاحقة آبكس. نشرح كيفية إرفاق إشارات محددة مستضد وكوستيمولاتوري آبكس وكيفية الاستفادة منها لإثراء لخلايا تي حدة مستضد وكيفية توسيع نطاق خلايا محددة مستضد تي. وعلاوة على ذلك، سوف نسلط الضوء التصميم الهندسي الاعتبارات استناداً إلى المعلومات التجريبية والبيولوجية من تجربتنا مع تميز خلايا تي محددة مستضد.
Introduction
مع ظهور العديد من إيمونوثيرابيس، هناك حاجة لتكون قادرة على توصيف والتحكم في الاستجابات المناعية. على وجه الخصوص، الاستجابة المناعية التكيفية للفائدة بسبب خصوصية ومتانة الخلايا. في الآونة الأخيرة، تمت الموافقة على العلاج خلايا تي مستقبلات مستضد تشيميريك لعلاج السرطان؛ ومع ذلك، تستند المستضد-المستقبلات قبالة المشتركة الخلية السطحي antigen CD19، بدلاً من مولدات المضادات الخاصة ب السرطان1. تتجاوز الخصوصية، يمكن إيمونوثيرابيس تعاني أيضا من عدم وجود مراقبة، وفهم الاستجابة المناعية الحيوية داخل السرطان أو المناعة الذاتية المحدودة.
يتمثل أحد التحديات دراسة استجابات محددة مستضد تلك الغاية منخفضة التردد، على سبيل المثال.، محددة مستضد خلايا تي هي 1 من كل 104 إلى6 ر 10 خلايا2،3. وهكذا، للتحقيق في أي تي الخلايا موجودة أو الاستجابة، الخلايا تحتاج إلى أما إثراء وتوسيع، أو الإشارة بحاجة إلى تفصيل. أنها مكلفة وصعبة للحفاظ على تغذية الخلايا باستخدام التقنيات الحالية التي تركز على توسيع نطاق خلايا محددة مستضد. التقنيات الحالية التي تركز على تضخيم إشارة محددة مستضد تي الخلايا، مثل الاعتداء إيمونوسبوت المرتبط بالانزيم (السبت)، والحد من إعادة استخدام تلك الخلايا تي4. أخيرا، بسبب حساسية منخفضة، غالباً ما هذه التقنيات اثنين تحتاج إلى تكون مجتمعة لتعداد محددة مستضد.
لمعالجة هذه القضايا، وقد وضعنا مستضد الاصطناعي المغناطيسي على أساس نانوحبيبات عرض الخلية (آبك)5،6،7،8. يمكن فونكتيوناليزيد آبك مع مجمع محددة مستضد إشارة هضميد تحميل histocompatibility رئيسية (الرهن العقاري)-وجزيئات كوستيمولاتوري-مثلاً.، جسم CD28 مكافحة-على حد سواء إثراء محددة مستضد خلايا تي ومن ثم في وقت لاحق حفز التوسع فيها (الشكل 1). وهكذا يمكن الجسيمات منتجات جاهزة فعالة من حيث التكلفة التي يمكن أن يكون على حد سواء تخصيصها لتلبية محددة مستضد التحفيز بعد موحدة عبر التجارب والمرضى. القيام بتخصيب اليورانيوم وتوسيع عملية النتائج في مئات آلاف إضعاف توسيع نطاق خلايا CD8 + “تي” حدة مستضد ويمكن أن ينتج ترددات تصل إلى 60 في المائة بعد أسبوع واحد فقط، يمكن توصيف أو الاستخدام العلاجي الكبير عدد الخلايا. هنا، ونحن تصف كيفية جعل نانوحبيبات آبكس، بعض اعتبارات التصميم الحاسم في اختيار خصائص نانوحبيبات، وإظهار بعض النتائج النموذجية عن طريق الاستفادة من هذه الجسيمات في عزل وتوسيع نطاق خلايا CD8 + “تي” محددة مستضد نادرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أنشأنا تكنولوجيا عزلة رواية خلية T حدة مستضد استناداً إلى مستضد نانوحبيبات الاصطناعية عرض الخلايا (آبكس). آبكس نانوحبيبات الببتيد-بتحميله MHC على السطح يسمح ملزمة محددة مستضد T الخلية والتنشيط جنبا إلى جنب مع تنشيط كوستيمولاتوري. آبكس باراماجنيتيك، هي أيضا، وهكذا يمكن استخدامها لإثراء …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بفضل J.W.H. في مركز تدريب تقنية النانو السرطان المعاهد الوطنية للصحة في معهد جونز هوبكنز النانوية، والوطني العلم مؤسسة الدراسات العليا بحوث الزمالة (DGE-1232825)، ومؤسسة جمعية الهلال الأحمر الأفغاني لدعم الزمالة. تم تمويل هذا العمل بدعم من المعاهد الوطنية للصحة (P01-AI072677، R01-CA108835، R21-CA185819)، ومبادرة الابتكار تيدكو/ولاية ماريلاند، ومؤسسة كولتر (JPS).
Materials
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 551263 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:Ig | BD Biosciences | 551323 | |
| DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion Protein | BD Biosciences | 550750 | |
| Vivaspin 20 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932362 | |
| Vivaspin 2 MWCO 50 000 | GE Life Sciences | 28932257 | |
| Purified Human Beta 2 Microglobulin | Bio-Rad | PHP135 | |
| nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticles | Micromod | 79-01-102 | |
| Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µm | Ocean Nanotech | SN0200 | |
| Anti-Biotin MicroBeads UltraPure | Miltenyi | 130-105-637 | |
| EZ-Link NHS-Biotin | ThermoFisher | 20217 | |
| Sulfo-SMCC Crosslinker | ProteoChem | c1109-100mg | |
| 2-Iminothiolane hydrochloride | Sigma-Aldrich | I6256 Sigma | |
| 96 Well Half-Area Microplate, black polystyrene | Corning | 3875 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain Clone R26-46 | BD Biosciences | 553434 | |
| FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG Clone G192-1 | BD Biosciences | 554026 | |
| B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) mice | Jackson Laboratory | 005023 | |
| C57BL/6J (B6 wildtype) mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, Mouse | Miltenyi | 130-104-075 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PE | Biolegend | 405203 | |
| N52 disk magnets of 0.75 inches | K&J Magnetics | DX8C-N52 | |
| APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7 | Biolegend | 100711 | |
| LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation | ThermoFisher | L-34969 |
References
- Prasad, V. immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11 (2018).
- Jenkins, M. K., Moon, J. J. The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude. The Journal of Immunology. 188 (9), 4135-4140 (2012).
- Rizzuto, G. A., et al. Self-antigen-specific CD8+ T cell precursor frequency determines the quality of the antitumor immune response. Journal of Experimental Medicine. 206 (4), 849-866 (2009).
- Newell, E. W., Davis, M. M. Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells. Nature biotechnology. 32 (2), 149 (2014).
- Perica, K., et al. Enrichment and expansion with nanoscale artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy. ACS nano. 9 (7), 6861-6871 (2015).
- Kosmides, A. K., Necochea, K., Hickey, J. W., Schneck, J. P. Separating T Cell Targeting Components onto Magnetically Clustered Nanoparticles Boosts Activation. Nano Letters. , (2018).
- Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation. Nano Letters. 17 (11), (2017).
- , ., et al. Efficient magnetic enrichment of antigen-specific T cells by engineering particle properties. Biomaterials. , (2018).
- Oelke, M., et al. Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy. Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).
- Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. Generation of CAR T cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care. Journal of visualized experiments: JoVE. (96), (2015).
- Ho, W. Y., Nguyen, H. N., Wolfl, M., Kuball, J., Greenberg, P. D. In vitro methods for generating CD8+ T-cell clones for immunotherapy from the naive repertoire. Journal of immunological methods. 310 (1-2), 40-52 (2006).
- Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII. 57 (2), 175-183 (2008).
- Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1. Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).
- Castle, J. C., et al. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).
- Duan, F., et al. Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity. Journal of Experimental Medicine. 211 (11), 2231-2248 (2014).
- Srivastava, P. K., Duan, F. Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges. Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).
- Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572 (2014).
- Gros, A., et al. Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients. Nature medicine. 22 (4), 433 (2016).
