Summary

Un metodo In Vivo per studiare l'integrità della barriera ematotesticolare di Mouse

Published: December 02, 2018
doi:

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per valutare l’integrità di barriera ematotesticolare iniettando inulina-FITC in testicoli. Si tratta di un metodo efficiente in vivo per studiare l’integrità della barriera ematotesticolare che può essere compromessa da elementi genetici e ambientali.

Abstract

Spermatogenesi sono lo sviluppo di spermatogoni in spermatozoi maturi nei tubuli seminiferi del testicolo. Questo processo è supportato da giunzioni delle cellule di Sertoli alla barriera ematotesticolare (BTB), che è la barriera più stretta di tessuto nel corpo dei mammiferi e segrega l’epitelio seminifero in due scomparti, una basale e un adluminal. La BTB crea un microambiente unico per le cellule germinali nella meiosi I / II e per lo sviluppo della postmeiotiche spermatidi in spermatozoi tramite spermiogenesi. Qui, descriviamo un test affidabile per monitorare l’integrità BTB del testicolo topo in vivo. Un intatto BTB blocca la diffusione di inulina FITC coniugato dal basale al compartimento apicale dei tubuli seminiferi. Questa tecnica è adatta per lo studio dei candidati gene, virus o tossici ambientali che possono influire sulla funzione BTB o integrità, con una procedura facile e un requisito minimo di abilità chirurgiche rispetto ai metodi alternativi.

Introduction

Spermatogenesi mammifera sono considerato un processo altamente strutturato che comprende degli spermatogoni auto-rinnovamento e differenziazione attraverso spermatociti in spermatozoi aploidi tramite mitosi e meiosi spermiogenesi, durante il quale drammatica si verificano cambiamenti biochimici e morfologici. Cellule germinali in via di sviluppo sono progressivamente trasportate dalla base del tubulo seminifero verso il lume. Questo processo è regolato da contatti cellula-cellula fra le cellule germinali e le cellule Sertoli1,2. Cellule di Sertoli adiacenti formano il BTB che si trova vicino alla base del tubulo seminifero. La BTB divide fisicamente l’epitelio in un basale e un vano di adluminal. Durante fasi VIII – IX del ciclo epiteliale, preleptotene/leptotene spermatociti dai comparti basali migrano attraverso il BTB, entrando il adluminal scomparti3. Di conseguenza, la funzione del BTB è di fornire un microambiente di nuova per il completamento della meiosi e spermiogenesi4,5,6. A differenza di altre barriere di sangue-tessuti (ad es., barriera emato – encefalica) che sono composti solo da giunzioni strette (TJs), il BTB è formata da quattro diverse giunzioni (TJs, specializzazioni ectoplasmatica, giunzioni di gap e basati su filamento intermedio desmosomi) tra Sertoli cells1,7.

Molti studi hanno utilizzato topi geneticamente modificati, infezioni da virus e tossici ambientali per studiare i meccanismi di BTB integrità7,8,9. La rottura di BTB induce la spermatogenesi alterata e infertilità o sterilità. Poiché la formazione di BTB e l’integrità sono stati confermati per essere influenzata dai contatti tra le cellule di Sertoli8, un modello in vitro basato su colture primarie di cellule di Sertoli isolate è stato usato per lo studio BTB. Tuttavia, questo modello non può simulare accuratamente BTB dynamics in vivo. Inoltre, nessun tale co-coltura delle cellule di germe con le cellule di Sertoli è stato stabilito come capace di riflettere tutti i relativi componenti strutturali e funzionali dei BTB10,11.

In generale, in vivo BTB integrità saggi sono in genere basati su piccole molecole, come EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotina e coniugato FITC inulina (inulina-FITC). Normalmente, la diffusione della biotina o inulina-FITC dal vano basale è bloccata dalla struttura BTB. Pertanto, siamo in grado di utilizzare questo metodo per valutare l’entità del danno BTB rispetto ai gruppi di controllo. Mentre BTB può essere compromessa con determinati tipi di stimoli, quali il trattamento con cadmio cloruro (CdCl2)12, BTB diventa accessibile a piccole molecole, che alla fine entrare nel compartimento di adluminal come indicatori.

Un’analisi iniziale di in vivo BTB integrità consiste nell’iniettare biotina o inulina-FITC nella vena giugulare, che comporta un intervento chirurgico ed è invasivo, complicato e richiede molto tempo. Inoltre, le sostanze di reporter diffondono attraverso tutto il corpo attraverso la circolazione, la concentrazione locale di biotina o inulina-FITC nei tubuli seminiferi è limitata. Inoltre, l’esposizione sistemica può indurre reazioni immuni. Qui, presentiamo un semplice ed efficace in vivo BTB integrità dosaggio consentendo ad iniezione diretta di una piccola aliquota di inulina-FITC nell’interstizio di un testicolo. Utilizzando il metodo di etichettatura fluorescente, il processo di colorazione è conveniente, come gli anticorpi secondari non sono necessari. Qui, il processo di tintura fluorescente entrando il testicolo è visualizzato.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali effettuati sono stati approvati dal Comitato Università medica di Nanchino. Topi maschii C57BL/6 sono stati tenuti sotto condizioni controllate fotoperiodo e sono stati forniti con cibo e acqua. 1. preparati Capillari di microiniezione Utilizzare i capillari microiniezione con un diametro esterno e interno dimeter lunghezza di 1.0 mm, 0.8 mm e 10,0 cm, rispettivamente. Tirare tubi capillari in vetro con un es…

Representative Results

Il set-up sperimentale per eseguire il dosaggio di integrità BTB è illustrato nella Figura 1. Tirare e affinare i capillari di microiniezione con un estrattore capillare e frese per micropipetta, rispettivamente (Figura 1A e 1C). Il riscaldatore termostatico e attrezzature per il microinjection sono illustrate nella Figura 1B e 1D. <p class="jove_content" fo:ke…

Discussion

Spermatogenesi avviene nell’epitelio seminifero ed è un processo altamente ordinato e dinamico che è disciplinato dalle cellule germinali e le cellule somatiche (per es., cellule di Sertoli)13. La struttura BTB, che è costruita dalle cellule di Sertoli, divide l’epitelio seminifero in un basale e un compartimento apicale. Lo sviluppo delle cellule germinali meiotiche e aploidi avviene nel compartimento apicale che forma una barriera immunologica14.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Quest’opera è stata sostenuta dalla chiave nazionale di R & D programma della Cina (2016YFA0500902), National Foundation Natural Science of China (31471228, 31771653), la Fondazione di scienza di Jiangsu per illustri giovani studiosi (BK20150047), la scienza naturale Fondazione della provincia di Jiangsu (BK20140897, 14KJA180005) e il programma Innovative e imprenditoriale della provincia di Jiangsu a K.Z.

Materials

Capillary puller  SUTTER INSTRUMENT (USA) P-97
10x PBS Hyclone (USA) SH30258.01 dilution to 1× in ddH2O
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma (USA) F6057
Adhesion microscope slides CITOGLAS (China) 80312-3161
Cadmium chloride Sigma (USA) 655198-5G
Confocal microscope Zeiss (Germany) LSM700
Dust-free paper Kimberly-Clark (USA) 34120
Inulin-FITC Sigma (USA) F3272
Microinjection capillaries Zhengtianyi (China) BJ-40 1.0 mm × 0.8 mm  × 100 mm
Micropipette beveler NARISHIGE (JAPAN) EG-400
OCT SAKURA (JAPAN) 4583
Paraformaldehyde Sigma (USA) P6148
Pentobarbital sodium Merck (Germany) P11011
Shaver  Yashen (China)
Stereo microscope Nikon (JAPAN) SMZ1000
Sucrose  Sangon Biotech (China) A610498
Surgical instruments Stronger (China) scissors, forceps, needle holder
Syringe KDL (China) 20163150518 0.45 mm × 0.16 mm RW LB
thermostatic heater KELL (Nanjing, China) KEL-2010
10x TBS, pH 7.6
0.2 M Tris Sangon Biotech (China) A600194
1.37 M Nacl Sangon Biotech (China) A610476

References

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Cite This Article
Liu, M., Zhu, C., Bai, S., Li, X., Fu, K., Ye, L., Zheng, K. An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity. J. Vis. Exp. (142), e58512, doi:10.3791/58512 (2018).

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