Um método In Vivo para estudar a integridade de barreira de sangue-testículo de rato

Espermatogênese de mamíferos é considerado um processo altamente estruturado que engloba espermatogónias auto-renovação e diferenciação através de espermatócitos em espermatozoides haploides através de mitose e meiose acridina, durante o qual dramática ocorrem alterações bioquímicas e morfológicas. Desenvolvimento das células germinativas são progressivamente transportadas da base do túbulo seminífero em direção ao lúmen. Este processo é regulado pelo celular os contactos entre as células germinativas e células de Sertoli^1,2. Células de Sertoli adjacentes formam o BTB que situa-se perto da base do túbulo seminífero. O BTB fisicamente divide o epitélio em um basal e um compartimento adluminal. Durante estágios VIII – IX do ciclo do epitélio, preleptotene/leptóteno espermatócitos de compartimentos do basais migram através do BTB, entrando o adluminal compartimentos³. Portanto, a função do BTB é fornecer um microambiente immunoprivileged a conclusão de meiose e acridina^4,5,6. Ao contrário de outras sangue-tecido barreiras (por exemplo, barreira hemato – encefálica) que são compostas apenas de junções apertadas (TJs), o BTB é formado por quatro diferentes junções (TJs, especializações ectoplásmicas, junções e intermediário baseado no filamento desmossomas) entre Sertoli células^1,7.

Muitos estudos utilizaram-se ratos geneticamente modificados, infecções por vírus e tóxicos ambientais para investigar mecanismos de BTB integridade^7,8,9. O rompimento do BTB induz a espermatogênese prejudicada e Subfertilidade ou infertilidade. Desde a formação do BTB e integridade foram confirmados para ser afetado pelos contatos entre as células de Sertoli⁸, um modelo in vitro com base em cultura primária de células de Sertoli isoladas tem sido utilizado para o estudo do BTB. No entanto, este modelo exatamente não pode imitar BTB dinâmica em vivo. Além disso, não há tal co-cultura de células germinativas com células de Sertoli estabeleceu como capaz de refletir todos os componentes estruturais e funcionais relevantes do BTB^10,11.

Em geral, ensaios de integridade em vivo BTB normalmente são baseados em pequenas moléculas, tais como o EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotina e inulina conjugado FITC (inulina-FITC). Normalmente, a difusão da biotina ou inulina-FITC do compartimento basal é bloqueada pela estrutura do BTB. Portanto, somos capazes de usar esse método para avaliar a extensão do dano BTB em comparação com grupos de controle. Enquanto BTB pode ser comprometida com certos tipos de estímulos, tais como tratamento com cádmio cloreto (CdCl₂)¹², BTB torna-se acessível para pequenas moléculas, os quais acabaram por inserir o compartimento adluminal como indicadores.

Um início na vivo BTB integridade ensaio envolve a injeção de biotina ou inulina-FITC na veia jugular, que envolve a cirurgia e é invasiva, complicado e demorado. Além disso, como as substâncias repórter difundem por todo o corpo através da circulação, a concentração local de biotina ou inulina-FITC nos túbulos seminíferos é limitada. Além disso, a exposição sistémica pode induzir reações imunes. Aqui, apresentamos um simples e eficaz na vivo BTB integridade ensaio permitindo injeção direta de uma pequena alíquota de inulina-FITC para o interstício de um testículo. Usando o método de rotulagem fluorescente, o processo de coloração é conveniente, como anticorpos secundários não são necessários. Aqui, o processo de tintura fluorescente entrando o testículo é visualizado.